多重PCR診斷豬5種繁殖障礙性疾病的方法研究.pdf

1、本實驗建立了一種同時檢測5種豬病毒性繁殖障礙病原體的多重PCR方法。采用Primer Premier 5.0和01igo 6.0引物設(shè)計軟件根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PPV的NSl基因、PCV2的oRF2、JEV的NSl基因、PRRSV的M基因以及PRV的gE基因序列設(shè)計了5對引物；分別擴(kuò)增長度為750bp、494bp、475bp、363bp、17 8bD的特異性片段。通過對影響PCR的幾個主要因素(包括反應(yīng)Buffer、反應(yīng)的退火溫

2、度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、Mg<'2+>濃度等)進(jìn)行優(yōu)化，建立了靈敏檢測這5種疾病的單項PCR方法；同時，還以PCV2為例就不同DNA抽提方法對擴(kuò)增效率的影響進(jìn)行了比較研究，通過比較確定了最佳的模板DNA抽提方法；對多聯(lián)PCR反應(yīng)中的Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和Mg<'2+>濃度等進(jìn)行優(yōu)化后，建立了在相同反應(yīng)程序下通過二聯(lián)和三聯(lián)兩個反應(yīng)體系(PPv-JEV，PCv2-PRRSV-PRV)對這5個核酸片段進(jìn)行有效擴(kuò)增

3、的多重PCR方法。敏感性實驗表明二聯(lián)PCR最低檢測限為：40.7TCID<,50>PPV，15.5TCID<,50>JEV；三聯(lián)PCR最低檢測限為：389TCID<,50>PRRSV、245TCID<<50>PRV，最低也能檢測到經(jīng)10<'-4>稀釋的PCV2抽提的DNA。實驗表明該方法能夠?qū)RV的野毒株和gE基因缺失疫苗株進(jìn)行鑒別，同時能夠區(qū)別PCV1和PCV2的感染；對PRv-SA215株、PCV1的核酸和健康豬淋巴結(jié)核酸抽提物均