PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR診斷方法及基因芯片診斷方法的建立.pdf

1、近年來，豬的疫病日益呈現(xiàn)復(fù)雜化和嚴(yán)重化趨勢，混合感染的比例大幅度上升，這一現(xiàn)狀也增加了臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷的難度。而豬瘟(Classical swine fever，CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)和豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus type2，PCV2)是目前威脅我國豬的主要傳染性疾病。所以建立集成的CSF、PRRS、PC

2、V2的多重PCR及基因芯片診斷方法顯得十分必要。
　　 本研究利用NCBI基因組比對方法挖掘PRRSV、PCV-2、CSFV基因組中的特異性序列，并結(jié)合引物及探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)和篩選相關(guān)PCR特異性引物及基因芯片的寡核苷酸探針。同時(shí)整合已報(bào)道的檢測探針和引物，利用篩選和整合的引物和探針建立并優(yōu)化多重PCR體系和基因芯片方法，檢測上述三種豬病毒性疾病。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.病毒的增殖與鑒定利用MARC-145、PK

3、-15、ST三種細(xì)胞分別增殖出了PRRSV歐洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、PCV-2、CSFV，其中PRRSV歐洲型、PRRSV美洲型毒株的增殖結(jié)果利用觀察其引起MARC-145細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變進(jìn)行初步判定，PCV-2、CSFV的增殖結(jié)果利用間接免疫熒光進(jìn)行初步判定，研究結(jié)果表明這幾種病毒均在相應(yīng)的易感細(xì)胞中得到了有效的增殖。
　　 2.多重PCR檢測體系根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PRRSV歐洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、

4、CSFV和PCV-24個(gè)病毒株基因序列，對各病毒基因區(qū)進(jìn)行同源性分析，設(shè)計(jì)合成4對特異性引物，然后進(jìn)行單基因PCR反應(yīng)特異性驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上建立和優(yōu)化了4種病原的多重PCR檢測體系，其最低檢測限可達(dá)104-10-5數(shù)量級，整個(gè)檢測時(shí)間在4h以內(nèi)。并分別用多重PCR和單項(xiàng)PCR/RT-PCR檢測60份臨床病料，符合率為100％，表明該檢測方法可以用于臨床病料的檢測，具有較大的應(yīng)用價(jià)值，可廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。
　　 3.基因芯片檢測

5、方法根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因序列，設(shè)計(jì)合成特異性引物和特異性較強(qiáng)的60mer左右的寡核苷酸探針，并將探針按所設(shè)計(jì)陣列固定于表面經(jīng)氨基化修飾的玻片上，制備出寡核苷酸芯片。然后進(jìn)行引物標(biāo)記及特異性驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上建立了帶標(biāo)記引物的多重PCR檢測體系，從而產(chǎn)生大量可與寡核苷酸探針特異性互補(bǔ)的帶標(biāo)記的DNA片段。將標(biāo)有熒光染料的擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上寡核苷酸探針雜交，掃描、分析芯片上熒光信號。試驗(yàn)結(jié)果表明