24個(gè)Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合檢測(cè)體系的建立及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、人類Y染色體屬于性染色體，為正常男性所特有，除擬常染區(qū)(pseudoautosomal region，PAR)外，在遺傳過程中不發(fā)生重組，其序列結(jié)構(gòu)除突變外由父代不變的傳遞給子代，同一父系人群的Y染色體在理論上相同。Y染色體的這一特性，使其在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)和親權(quán)鑒定方面有巨大應(yīng)用潛力。同時(shí)由于其具有男性特異性，在實(shí)際辦案中，對(duì)性侵犯、傷害等案件中提取到的男女混合檢材進(jìn)行鑒定時(shí)，Y染色體遺傳標(biāo)記檢驗(yàn)技術(shù)更有其特殊的價(jià)值，能夠獲得男性個(gè)體Y

2、染色體遺傳信息同時(shí)不受女性成分影響。鑒于以上特點(diǎn)，Y染色體長(zhǎng)期以來都是作為重要的研究檢驗(yàn)對(duì)象被應(yīng)用于法醫(yī)物證檢驗(yàn)。
　　 針對(duì)Y染色體第二代遺傳標(biāo)記——短串聯(lián)重復(fù)序列( STR，short tandemrepeats)而進(jìn)行的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)，是目前應(yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的Y染色體遺傳信息檢驗(yàn)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)信息通量高、結(jié)果數(shù)字化顯示易于存儲(chǔ)比對(duì)等優(yōu)點(diǎn)?；谶@一技術(shù)而開發(fā)的各種商業(yè)化試劑盒，已經(jīng)在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)鑒定中

3、得到廣泛應(yīng)用。2003年P(guān)romega公司推出的PowerPlexTMY試劑盒在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增12個(gè)Y-STRs基因座，其中包括ISFH(International Society of Forensic Haemogenetics)認(rèn)定的歐洲 MHL(最小單倍型，minimal haplotypes loci)的9個(gè)基因座及SWGDAM(美國(guó)DNA分析方法科學(xué)工作組,Scientific Working Group On DNA

4、 Analysis Methods)推薦的11個(gè)基因座。2004年由ABI公司推出的AmpFISTR Y filerTM試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)同步擴(kuò)增檢測(cè)17個(gè)Y-STR基因座。但這些現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒主要是按照歐洲人群統(tǒng)計(jì)選擇的基因座位點(diǎn)，其中不少基因座的多態(tài)性在中國(guó)人群中比較低，如DYS391在中國(guó)人群中多態(tài)性小于0.4，加之基因座數(shù)量少，造成了系統(tǒng)整體個(gè)體識(shí)別能力低，在法醫(yī)鑒定的實(shí)際應(yīng)用中有時(shí)會(huì)遇到瓶頸，特別是近年隨著DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展

5、，比對(duì)樣本基數(shù)的增加，Y-STR作為家系排查的主要比對(duì)指標(biāo)，現(xiàn)有Y-STR檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別率不足的缺點(diǎn)日益突出，影響了其數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)效能，出現(xiàn)了如嫌犯與多個(gè)不同家系的Y-STR單倍型匹配，造成無法排查的情況，或者由于Y-STR突變，造成家系比對(duì)無法確定或誤判的情況。
　　 因此，開發(fā)一種針對(duì)中國(guó)人群的多態(tài)性高、性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單和能同時(shí)檢測(cè)更多基因座的Y-STR檢測(cè)體系，成為我國(guó)法醫(yī)物證檢驗(yàn)鑒定的迫切需要。
　　 本文根據(jù)過去

6、十幾年國(guó)內(nèi)外針對(duì)中國(guó)人群Y-STR的研究，選擇針對(duì)中國(guó)男性的GD(基因多態(tài)性，gene diversity)數(shù)值較高的Y-STR基因座，建立了24個(gè)Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系，有效提高Y-STR檢測(cè)體系對(duì)中國(guó)人群的鑒別能力和效率，解決了現(xiàn)有Y-STR熒光檢驗(yàn)試劑盒識(shí)別能力不足的難題。
　　 本文通過查閱文獻(xiàn)，從中選取DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/

7、b、DYS446、DYS443、DYS587、 DYS527a/b、DYS460、Y—GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、 DYS570、DYS444等未在現(xiàn)有商業(yè)試劑盒體系內(nèi)、在中國(guó)人群中基因多態(tài)性高(GD＞0.6)、且等位基因跨度較小的基因座21個(gè)，考慮到需要與現(xiàn)有商業(yè)試劑盒聯(lián)用，特地加入DYS635和DYS385a/b三個(gè)基因座，同時(shí)應(yīng)用目前最先進(jìn)的5色熒光標(biāo)記，將24個(gè)基因座分成四組，使用6

8、-FAM、HEX、TAMRA、ROX分組標(biāo)記，分子量?jī)?nèi)標(biāo)用第五色熒光染料SIZ（橙色熒光，無錫中德美聯(lián)公司）標(biāo)記，組成24個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系。隨后通過先對(duì)24個(gè)基因座的單一擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，在成功地建立了單個(gè)基因座擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上，研究24個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件，通過實(shí)驗(yàn)確定了復(fù)合擴(kuò)增體系的循環(huán)參數(shù)、緩沖液離子強(qiáng)度、酶量、復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體積以及熒光標(biāo)記引物濃度等，使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到平衡、特異的要求，建立穩(wěn)定、均衡的復(fù)合擴(kuò)增

9、體系，實(shí)現(xiàn)同時(shí)擴(kuò)增24個(gè)Y-STR基因座。
　　 本文通過編制GeneMapper ID3.2分析文件panel、bins，使用混合單基因座擴(kuò)增產(chǎn)物方法制作等位基因標(biāo)準(zhǔn)物ladder，使用5色熒光Matrix與SIZ-500內(nèi)標(biāo)，建立了基于ABI基因分析儀的自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢驗(yàn)方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用3130XL型遺傳分析儀進(jìn)行電泳檢測(cè)，用軟件Foundation data collection收集原始掃描數(shù)據(jù)，GeneMappe

10、r ID3.2進(jìn)行Y-STR基因分型。對(duì)24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系的男性特異性、家系穩(wěn)定性、種屬特異性、靈敏度、人體細(xì)胞同一性等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步驗(yàn)證了該體系特異性好、性能穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏。
　　 本文應(yīng)用建立的24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)146份廣東地區(qū)無關(guān)男性個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用AmpFISTR YfilerTM試劑盒進(jìn)行比較檢測(cè)，得到Y(jié)— STR分型數(shù)據(jù)后，用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各等位基因頻率?；?/p>

11、因多態(tài)性(genediversity，GD)及單倍型多樣性(haplotype diversity，HD)，按公式h=n(1-Σpi2)/(n-1)計(jì)算（n為樣本例數(shù)，Pi為等位基因頻率）。并計(jì)算累積的GD值(TGD，相當(dāng)于常染色體STR評(píng)估指標(biāo)中的累積非父排除率CPE)按公式TGD=1-(1-GD1)(1-GD2)(1-GD3)(1-GD4)...(1-GDn)計(jì)算（GDn為各基因座的GD值）。24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系共得到145

12、種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，單位點(diǎn)GD值為0.55(DYS531)～0.96(DYS385a/b)，HD值為0.99972，TGD值為1-1.88E-14; YfilerTM系統(tǒng)的共得到143種單倍型，其中141種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，1種單倍型出現(xiàn)3次，單位點(diǎn)GD值為0.36(DYS389)～0.96(DYS385a/b)，HD值為0.99858，TGD值為1-4.97E-9;24個(gè)Y-ST

13、R復(fù)合擴(kuò)增體系與yfilerTM系統(tǒng)聯(lián)用的共得到145種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，HD值為0.99972，TGD值為1-1.066E-20。
　　 研究表明，本文建立的24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系穩(wěn)定、高效、操作簡(jiǎn)單易用，特異性強(qiáng)，可滿足日常法醫(yī)物證Y-STR檢驗(yàn)需要，具有良好的中國(guó)人群針對(duì)性，系統(tǒng)識(shí)別率高于目前最常用的商業(yè)AmpFISTR YfilerTM試劑盒，能夠很好的解決目前Y-STR商業(yè)試