熒光標(biāo)記miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系的建立及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR，short tandem repeats)或稱微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA)是廣泛存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的。DNA序列，由2～6bp順序相同的重復(fù)序列單位(又稱核心序列)首尾串聯(lián)重復(fù)排列組成。作為第二代遺傳標(biāo)記，STR分析已被廣泛應(yīng)用于遺傳制圖、遺傳連鎖性分析、親子鑒定、疾病基因定位、物種多態(tài)性研究和組織移植評價等諸多領(lǐng)域。隨著STR分析技術(shù)的迅速發(fā)展，其在法庭科學(xué)領(lǐng)域中的作用

2、也愈來愈大，現(xiàn)在基于STR技術(shù)的STR—PCR．分型已經(jīng)成為了國內(nèi)外法醫(yī)個人識別和親子鑒定最主要的手段。 但是，在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)經(jīng)常面臨DNA降解的檢材，檢材所處環(huán)境的溫度、濕度、光、化學(xué)及生物因素，尤其是酸或堿、高溫、潮濕、暴曬、微生物等因素都會導(dǎo)致DNA分子受到損害，DNA鏈發(fā)生斷裂，DNA片段的完整性受到極大的破壞。這種現(xiàn)象在陳舊的骨骼、牙齒以及腐敗的肌肉組織中尤為常見，在應(yīng)用商品化STR試劑盒進(jìn)行DNA分型時可能會出現(xiàn)“

3、優(yōu)勢擴(kuò)增”或者“無效擴(kuò)增”，主要表現(xiàn)為：擴(kuò)增片段較大的STR基因座擴(kuò)增效率降低，出現(xiàn)等位基因缺失甚至完全丟失。因此，進(jìn)行高度降解的DNA的STR分型成為法醫(yī)檢驗(yàn)的難點(diǎn)。雖然也可以應(yīng)用線粒體DNA高變區(qū)(mitochondrial DNA hypervariable region)來對腐敗降解的檢材進(jìn)行分析，但對于許多法庭科學(xué)實(shí)驗(yàn)室來說，線粒體DNA的檢測費(fèi)時費(fèi)力，而且成本較高，另外線粒體DNA呈單倍體母系遺傳，個人識別力遠(yuǎn)低于STR，不

4、能進(jìn)行個人認(rèn)定。 STR基因座的多態(tài)性表現(xiàn)為個體間核心序列重復(fù)次數(shù)的不同。STR-PCR分型技術(shù)的策略是設(shè)計含括重復(fù)序列的引物對其進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，然后通過電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測其片段長度的差異，從而進(jìn)行STR等位基因分型。引物位置決定PCR產(chǎn)物的大小。在設(shè)計引物時，使其盡可能結(jié)合在更靠近核心重復(fù)序列的側(cè)翼序列，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物盡可能縮短，這就是miniSTR技術(shù)。與目前常用的STR基因座相比，其擴(kuò)增片段明顯縮短，對降解的DNA

5、小片段分型成功率更高，但由于核心序列的重復(fù)次數(shù)沒有改變，因而分型結(jié)果與目前常用的體系相同。本課題旨在建立新型的miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系，并對其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行研究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： (一)建立三個熒光標(biāo)記miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系按照復(fù)合擴(kuò)增基因座選擇的原則和實(shí)驗(yàn)嘗試，設(shè)計引物，組合并建立三個miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系，其中miniCTTA體系包含CSFlPO、TPOX、TH01和Amelogenin基因座；miniDD

6、D體系包含D5S818、D8S1179和D16S539基因座；miniDDV體系包含D13S317、D21S11和vWA基因座。對各個體系的擴(kuò)增條件分別進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度、引物濃度、緩沖液的組成、酶的用量以及Mg<'2+>濃度等：PCR反應(yīng)條件，成功地建立了三個熒光標(biāo)記miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系并制備其相應(yīng)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。三個體系各基因座的擴(kuò)增片段縮89～211bp，分別較商品化試劑盒產(chǎn)物片段縮短25～191bp。比較對100

7、個樣本：miniSTR體系和商品化試劑盒的分型結(jié)果，顯示分型結(jié)果一致，分型準(zhǔn)確。 對15種常見的動物(猴、豬、狗、牛、羊、雞、鴨、魚、貓、兔、豚鼠、家鼠、鱔魚、蛙和人)提取DNA后進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其具有人的種屬特異性。梯度稀釋Control DNA 9947(濃度為0.1ng/μl)，測定miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系的靈敏度，顯示其靈敏度可達(dá)50pg。 (二)應(yīng)用鏈霉親和素磁珠分離手段建立兩個miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系同步擴(kuò)

8、增技術(shù)對miniDDD體系正向引物的5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記，對miniDDV正向和反向引物的5’端分別采用熒光素和生物素進(jìn)行標(biāo)記，同步擴(kuò)增兩個體系，將親和素連接于磁珠上，利用生物素與親和素的高親和力(1×10<'-5>)，使兩個體系的PCR產(chǎn)物在磁場下得到有效分離。通過這種方法可對6個mini-STR基因座進(jìn)行同步擴(kuò)增，能節(jié)約檢材，提高檢測信息量。 (三)miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系在降解：DNA模板中的應(yīng)用取足量的腐敗組織，酚．氯