改良擴(kuò)增前引物延伸方法的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景與目的 在法醫(yī)學(xué)檢案實(shí)踐中，常遇到樣本DNA含量極其有限，以致DNA分型無法完成或不能滿足重復(fù)檢測的需要。因此，對(duì)微量模板DNA分析便成為法醫(yī)學(xué)DNA檢驗(yàn)的一個(gè)難題。以PCR-STR為代表的遺傳標(biāo)記分析技術(shù)雖然一定程度上解決了法醫(yī)學(xué)微量檢材的難題，但一些檢材仍因DNA含量極其有限而無法檢測成功，或僅檢出少數(shù)基因座而無法使累計(jì)鑒別能力達(dá)到認(rèn)定水平。這類檢材被稱為痕量DNA，也稱低拷貝模板(low copy number，L

2、CN)，Gill等將其定義為低于100pg的模板DNA。為解決這一難題，有研究用增加PCR循環(huán)數(shù)，但模板DNA量太低時(shí)易產(chǎn)生等位基因丟失或非特異帶，且循環(huán)數(shù)增加到一定程度后再增加循環(huán)數(shù)也不會(huì)顯著增加靈敏度；另外，有人試圖用巢式PCR，但巢式PCR技術(shù)僅限于單一位點(diǎn)分析，無法提高目前法醫(yī)學(xué)中常規(guī)DNA檢測所用的多位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增所需的模板數(shù)量。全基因組擴(kuò)增(Whole Genome Amplification，WGA)是一種能從有限的DNA樣

3、品獲得充足的DNA量供后續(xù)分析的技術(shù)，其基本思路是通過對(duì)微量組織甚至單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA擴(kuò)增，大幅度增加DNA的總量。因此被認(rèn)為是目前可以解決上述難題的一種有效方法。 WGA技術(shù)經(jīng)10余年探索，在方法上已逐步發(fā)展和不斷完善起來，已被廣泛用于疾病基因研究等領(lǐng)域，并取得了良好的效果。但在法醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用很少。在目前常用的幾種wGA方法中，改良擴(kuò)增前引物延伸方法(Improved primerextension preampli

4、fication，IPEP)和多重置換擴(kuò)增方法(multipledisplacement amplification，MDA)對(duì)STR基因座分型顯示出較好的效果。故本研究探討了這兩種方法用于法醫(yī)學(xué)微量檢材的效果，包括對(duì)其靈敏度、擴(kuò)增忠實(shí)性、能否用于法醫(yī)學(xué)常用STR基因座及常用檢材等進(jìn)行系統(tǒng)性研究，從而對(duì)其用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐的可行性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并建立穩(wěn)定可行的技術(shù)方案。 方法：1．對(duì)30例口腔拭子樣品，采用酚－氯仿法提取DNA，實(shí)時(shí)熒光

5、定量PCR技術(shù)定量，并分別稀釋成1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng六種模板量DNA，然后進(jìn)行MDA反應(yīng)和IPEP反應(yīng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測MDA方法和IPEP方法的產(chǎn)物濃度，比較兩種方法的擴(kuò)增效率。分別以MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物為模板DNA，用AmpFLSTR Identifiler 試劑盒擴(kuò)增，ABl3100基因分型儀檢測基因型，比較MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物用于STR分型的效果。

6、 2．對(duì)IPEP方法反應(yīng)體系的成分和終濃度進(jìn)一步優(yōu)化，建立改良IPEP方法，并檢測其擴(kuò)增效率和STR分型效果。將改良IPEP方法用于30例血液、30例血紗、30例精液等三類法醫(yī)學(xué)常見生物檢材進(jìn)行檢測，觀察改良IPEP方法的可重復(fù)性和對(duì)法醫(yī)學(xué)常見生物性檢材的適用性。 3．將改良IPEP方法用于20例汗?jié)撝赣　?0例一次性牙刷、20例自然脫落頭發(fā)等三種法醫(yī)學(xué)常見疑難微量檢材的模擬案例，觀察改良IPEP方法對(duì)上述檢材的STR分型效果

7、；用于現(xiàn)場果核10例、礦泉水瓶10例、煙蒂10例、衣領(lǐng)10例等實(shí)際案例樣品，觀察改良IPEP方法對(duì)實(shí)際案件中微量DNA樣品的檢驗(yàn)效果。 結(jié)果 1．MDA法產(chǎn)量為5.15μg～19.75μg，可對(duì)模板DNA增加5.15×10<'3>～1.98×10<'6>倍；IPEP法產(chǎn)量為0.5ng～66ng，可對(duì)模板DNA增加25～310倍。MDA法產(chǎn)物濃度高于IPEP法，差異有顯著性意義(F=3643.433，P<0.001)。

8、 2．常規(guī)檢測法、MDA法、IPEP法的基因座檢出數(shù)有顯著性差異(F=1033.297，P<0.001)。當(dāng)DNA模板量為1ng時(shí)，常規(guī)檢測方法、MDA方法、IPEP方法均可獲得復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)所有基因座的準(zhǔn)確分型結(jié)果；當(dāng)DNA模板量為0.5ng時(shí)，常規(guī)檢測方法和IPEP方法均獲得所有基因座的準(zhǔn)確分型結(jié)果，MDA法獲得10個(gè)以上基因座的準(zhǔn)確分型結(jié)果；當(dāng)DNA模板量為0.1ng～0.01ng時(shí)，MDA法基因座檢出數(shù)高于常規(guī)檢測法，IPEP

9、法基因座檢出數(shù)高于MDA法。3．DNA模板量≥1ng，其MDA產(chǎn)物雜合子基因座的等位基因擴(kuò)增均衡：DNA模板量≤0.5ng，其MDA產(chǎn)物的STR分型圖譜可見等位基因不平衡或丟失現(xiàn)象，且模板DNA量越低，等位基因不平衡或丟失現(xiàn)象越明顯。DNA模板量≥0.05ng，其IPEP產(chǎn)物雜合子基因座的等位基因擴(kuò)增均衡；DNA模板量≤0.025ng，其IPEP產(chǎn)物的STR分型圖譜可見等位基因不平衡或丟失。MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物用于STR分型時(shí)均未觀

10、察到非特異產(chǎn)物峰。 4．采用保真性更好的DNA聚合酶和增加隨機(jī)引物用量，建立了改良IPEP方法。0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng四組模板量DNA經(jīng)改良IPEP法擴(kuò)增所得產(chǎn)物濃度均高于IPEP法，差異有顯著性(F=289.899，P<0.001)。改良IPEP法對(duì)上述模板DNA擴(kuò)增獲得3ng～84ng產(chǎn)物，可使模板DNA增加160～1220倍。DNA模板量為0.025ng時(shí)，改良IPEP方法可獲得完整準(zhǔn)確的分

11、型結(jié)果。DNA模板量為0.01ng時(shí)，改良IPEP法的平均基因座檢出數(shù)高于IPEP法，部分基因座仍未檢出，以D7S820、D18S51、FGA等較常見。改良IPEP方法的產(chǎn)物用于STR分型時(shí)，未見非特異產(chǎn)物峰及等位基因不平衡或丟失。 5．改良IPEP方法對(duì)0.025ng血液DNA、血紗DNA、精液DNA檢測均獲得所有基因座的準(zhǔn)確分型結(jié)果。 6．改良IPEP方法可顯著提高汗?jié)撝赣NA(t=5.423，P<0.001)、一

12、次性牙刷DNA(t=6.835，P<0.001)的基因座檢出數(shù)，但對(duì)自然脫落毛發(fā)DNA的基因座檢出數(shù)低于常規(guī)檢測法(t=3.249，P<0.001)。改良IPEP方法對(duì)實(shí)際案件中果核、杯口、煙蒂、衣領(lǐng)等檢材的的檢測成功率和平均基因座檢出數(shù)均高于常規(guī)檢測方法，且檢出STR基因座數(shù)均不少于9個(gè)。 結(jié)論 1．MDA法產(chǎn)量高，但靈敏度低，當(dāng)模板量低于1ng時(shí)，產(chǎn)物序列保真性差，影響后續(xù)STR分型的準(zhǔn)確性。因此，MDA法可能不適用

13、于痕量DNA檢測。 2．IPEP法靈敏度高，產(chǎn)物序列保真性好，對(duì)0.05ng的基因組DNA可獲得良好的STR分型效果，但產(chǎn)量低。 3．DNA聚合酶和隨機(jī)引物用量對(duì)IPEP方法有重要影響。采用保真性更好的DNA聚合酶和增加隨機(jī)引物至一定終濃度，提高了擴(kuò)增效率。在此基礎(chǔ)上建立的改良IPEP方法的產(chǎn)物序列保真性好，且產(chǎn)量和靈敏度都進(jìn)一步提高，改善了痕量DNA的STR分型效果。 4．改良IPEP方法對(duì)于口腔拭子、血液、血