Renin和IL-10基因與豬妊娠期的相關(guān)性研究.pdf

1、妊娠期是豬重要的繁殖性狀之一。在生產(chǎn)過程中縮短母豬的妊娠期可以縮短其繁殖周期，提高母豬的繁殖效率，降低生產(chǎn)成本。妊娠期是數(shù)量性狀，由多基因的控制的，且單個(gè)基因的效應(yīng)值較小，易受環(huán)境因素的影響，用常規(guī)的育種方法對(duì)其進(jìn)行遺傳改良進(jìn)展緩慢。
　　 有研究報(bào)道影響豬妊娠期的QTL位于豬的第1、9和15號(hào)染色體上，根據(jù)豬-人基因組比較圖譜和基因的生理生化功能選取了兩個(gè)候選基因：腎素（Renin）和白介素-10（IL-10）。應(yīng)用生物信息學(xué)

2、和比較基因組的方法對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了克隆，經(jīng)不同品種間序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的突變位點(diǎn)，并選擇三個(gè)突變位點(diǎn)與妊娠期和產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析：
　　 1．根據(jù)與人的Renin基因有較高同源性的豬EST以及人和小鼠等物種該基因cDNA相似性較高的區(qū)域設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，以梅山豬cDNA作為模板擴(kuò)增、克隆并測(cè)序，拼接后獲得1333 bp的整合cDNA序列，包含全部CDS和部分5’和3’非翻譯區(qū)。利用獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)18對(duì)引物對(duì)其DN

3、A序列進(jìn)行擴(kuò)增，克隆、測(cè)序和拼接后得到了13332bp的DNA序列。
　　 2．利用Clustal X、ORF Finder、Spidey、MEGA4.0、PSORT Ⅱ等軟件對(duì)豬Renin基因結(jié)構(gòu)、編碼的蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、系統(tǒng)進(jìn)化樹等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。本文發(fā)現(xiàn)該基因共有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子且內(nèi)含子的剪切方式符合“GT-AG”法則，進(jìn)化樹分析得出該基因與反芻動(dòng)物的相似性最高，與嚙齒類的次之，與靈長(zhǎng)類的最低。
　　

4、 3．根據(jù)豬IL-10基因的cDNA序列設(shè)計(jì)7對(duì)引物，克隆得到了該基因4062 bp的DNA序列，經(jīng)過對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，該基因包含有4個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子的剪切方式符合“GT-AG”法則。
　　 4．根據(jù)已獲得的Renin基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR的方法檢測(cè)其在不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在腎、卵巢和輸卵管中有表達(dá)，在腎中的表達(dá)最高。
　　 5．根據(jù)獲得的這兩個(gè)基因的序列，清平豬、大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克

5、豬的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增、克隆并測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了在Renin的第6內(nèi)含子228bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)C/T轉(zhuǎn)換，第7內(nèi)含子的114bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)A/G轉(zhuǎn)換和IL-10基因第3內(nèi)含子的835bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)A/G轉(zhuǎn)換，據(jù)此建立適宜的PCR-RFLP SNP分型方法。
　　 6．Renin的第6內(nèi)含子內(nèi)的突變可以被HhαⅠ酶切，建立該基因的PCR-Hhα Ⅰ-RFLP檢測(cè)方法，對(duì)該位點(diǎn)在清平豬、新清平豬、長(zhǎng)白豬、大白豬，杜洛克豬和中

6、國瘦肉豬新品系DⅣ1系、DⅣ2系7個(gè)中外豬群體中進(jìn)行基因型分型，分析了它們的基因型頻率和基因頻率，并與妊娠期和產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)TT基因型在國外豬種中占有優(yōu)勢(shì)，地方品種和培育品種與外種豬的基因型頻率之間均存在顯著地差異，且都達(dá)到了極顯著的水平。該位點(diǎn)在新清平豬中對(duì)于妊娠期的顯性效應(yīng)達(dá)到了顯著地水平。在DⅣ1系中CC基因型的妊娠期要顯著高于TT和CT基因型的妊娠期。該位點(diǎn)在不同的群體中對(duì)于產(chǎn)仔數(shù)的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)均不顯

7、著。
　　 7．Renin基因第7內(nèi)含子內(nèi)的突變可以被bstx Ⅰ酶切，建立該基因的PCR-bstx Ⅰ -RFLP檢測(cè)方法，在清平豬、新清平豬、長(zhǎng)白豬、大白豬杜洛克豬和中國瘦肉豬新品系DⅣ1系、DⅣ2系7個(gè)中外豬群體中進(jìn)行基因型分型，分析了它們的基因型頻率和基因頻率，并與妊娠期和產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)A等位基因在各個(gè)豬群中占有優(yōu)勢(shì)，在杜洛克豬中除外。大部分豬群之間基因型頻率差異顯著。在新清平豬中該位點(diǎn)對(duì)于妊娠期的

8、顯性效應(yīng)差異顯著，為0.93d。該位點(diǎn)在杜洛克豬中對(duì)于產(chǎn)仔數(shù)的加性效應(yīng)達(dá)到極顯著地水平，GG基因型的產(chǎn)仔數(shù)要顯著地高于AG和從基因型的產(chǎn)仔數(shù)。
　　 8．IL-10的第3內(nèi)含子內(nèi)的突變可以被Ec081 Ⅰ酶切，建立該基因的PCR-Ec081Ⅰ-RFLP檢測(cè)方法，在清平豬、新清平豬、長(zhǎng)白豬、大白豬杜洛克豬和中國瘦肉豬新品系DⅣ1系、DⅣ2系7個(gè)中外豬群體中進(jìn)行基因型分型，分析了它們的基因型頻率和基因頻率，并與妊娠期進(jìn)行相關(guān)性分析，