諾氟沙星免疫分析化學(xué)研究.pdf

1、本文以諾氟沙星為研究對象，并合成了諾氟沙星的半抗原 (NFLX-Hp)，經(jīng)過提純后用紅外吸收光譜，質(zhì)譜和核磁共振圖譜來測定半抗原的結(jié)構(gòu)。采用活性酯法將半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共價(jià)偶聯(lián)，制備人工抗原和包被原，經(jīng)紫外掃描確定偶聯(lián)情況并計(jì)算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比。以NFLX-Hp-BSA為免疫原免疫新西蘭白兔，制備針對半抗原的特異性抗血清。間接ELISA法測定抗血清的中點(diǎn)效價(jià)達(dá)6.41×10<'4>，雙向瓊

2、脂擴(kuò)散法測定抗血清的效價(jià)達(dá)1/64。兔頸動(dòng)脈放血得抗血清，以硫酸銨分步鹽析法分離純化抗血清中的抗體并凍干，-20℃保存。采用活性酯法制備酶標(biāo)半抗原(NFLX-Hp-HRP)，透析去除游離半抗原等小分子，再經(jīng)Sephadex柱純化；酶標(biāo)半抗原既保持了免疫化學(xué)活性，又保持了酶活性，可用于免疫化學(xué)分析。 進(jìn)一步研究了pH值、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈、丙酮)對包被抗體－酶標(biāo)半抗原(E-H)直接競爭ELISA法的影響。結(jié)果表明：當(dāng)包

3、被介質(zhì)的pH值為6.2時(shí)，固相載體對抗體的吸附性最好；當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)的pH值同樣為6.2時(shí)，抗體與諾氟沙星的親和作用最強(qiáng)。離子強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)增大會(huì)提高抗體與諾氟沙星的親和力；甲醇、乙腈和丙酮含量大于5％影響諾氟沙星的免疫分析結(jié)果。 成功建立了諾氟沙星直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法，方陣試驗(yàn)確定了抗體的最佳包被濃度為10μg/mL，酶標(biāo)半抗原最佳稀釋度為16000倍。在優(yōu)化條件下，建立了諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，回歸方程I=16.17Lo

4、gC+67.57，r<'2>=0.978，線性范圍為100～0.01μg/mL，抑制中濃度(IC<,50>)為0.082μg/mL，IC<,20>為1.14ng/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=8.33(n=5)。 抗體的特異性考察結(jié)果表明，半抗原的交叉反應(yīng)率最大為38139.535，左氧氟沙星(Levofloxacin)、環(huán)丙沙星 (Ciprofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)的交叉反應(yīng)率分別為8.884、

5、3.306和0.869。 在空白雞血清中分別添加諾氟沙星標(biāo)樣，使樣品中諾氟沙星的含量分別為0.5mg/kg和5mg/kg兩個(gè)水平。添加樣品用1.0mol/mL的鹽酸提取，E-H直接競爭EIdSA法測定，重復(fù)4次。諾氟沙星添加濃度為0.5 mg/kg時(shí)，回收率86.34％～107.40％，平均值為97．285％，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8．86；諾氟沙星添加濃度為5 mg/kg時(shí)，回收率81.11％～101.91％，平均值