錦鋰皰疹病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與抗病毒藥物篩選.pdf

1、鯉魚，包括觀賞性的錦鯉，是歐洲和亞洲的重要淡水養(yǎng)殖品種，具有重要的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)價(jià)值。然而，自1998年在以色列和美國暴發(fā)錦鯉皰疹病毒病以來，錦鯉皰疹病毒病隨后在全球范圍流行。錦鯉皰疹病毒病的病原為錦鯉皰疹病毒(KoiHerpesvirus，KHV)，因其是從鯉科魚體內(nèi)分離鑒定的第三個(gè)皰疹病毒，因此其又稱為鯉皰疹病毒Ⅲ型(CyprinidHerpesvirus3，CyHV-3)。由KHV感染養(yǎng)殖鯉魚引起的皰疹病毒病是近年嚴(yán)重危害我國鯉魚養(yǎng)殖

2、業(yè)的一種重大傳染性疾病，已經(jīng)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，錦鯉皰疹病毒病尚無有效的防治方法。本文研究了KHV感染錦鯉鰭條細(xì)胞(Koi-Fin)誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡的過程，并在建立的細(xì)胞感染系統(tǒng)中進(jìn)行了抗錦鯉皰疹病毒天然藥物篩選，為錦鯉皰疹病毒病防治技術(shù)研究與應(yīng)用奠定了前期基礎(chǔ)。研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.錦鯉皰疹病毒(KHV)感染錦鯉鰭條細(xì)胞(Koi-Fin)誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡的研究。KHV感染錦鯉鰭條細(xì)胞(Koi-Fin)，根據(jù)凋亡形態(tài)學(xué)特征

3、檢測，采用hoechst33258染色檢測方法，根據(jù)凋亡生化特征檢測，采用TUNEL反應(yīng)、DAN片段化檢測、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期以及流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位變化方法，研究了KHV誘導(dǎo)Koi-Fin細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程。KHV感染錦鯉鰭條細(xì)胞后，細(xì)胞變圓、皺縮、折光度增強(qiáng)，隨后細(xì)胞脫落，細(xì)胞單層呈網(wǎng)狀，感染96h后出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。KHV感染Koi-Fin細(xì)胞72h后，hoechst33258染色結(jié)果顯示，KHV感染Koi

4、-Fin細(xì)胞72h后，Koi-Fin細(xì)胞的染色質(zhì)固縮亮染、細(xì)胞核邊緣化或破裂，出現(xiàn)質(zhì)膜包被的凋亡小體，且Koi-Fin細(xì)胞凋亡率與KHV感染細(xì)胞時(shí)間成正相關(guān);TUNEL反應(yīng)結(jié)果表明，KHV感染72h后，細(xì)胞基因組DNA出現(xiàn)斷裂，有大量3'-OH末端存在。DNAladder檢測結(jié)果顯示，KHV感染Koi-Fin細(xì)胞48h后，瓊脂糖凝膠電泳顯示梯帶條帶，且隨感染時(shí)間延長而逐漸增強(qiáng)，96h達(dá)到最高。病毒感染72h后流式細(xì)胞儀檢測亞G1期細(xì)胞，

5、結(jié)果顯示，被KHV感染的細(xì)胞約42.8％處于凋亡細(xì)胞特有的亞G1期;采用JC-1熒光探針檢測KHV感染Koi-Fin細(xì)胞的線粒體膜電位變化，結(jié)果表明，KHV感染Koi-Fin細(xì)胞72h后，其線粒體膜電位降低，通透性發(fā)生改變。
　　2.抗KHV藥物篩選的研究。采用細(xì)胞病變效應(yīng)觀察和活細(xì)胞染色法(MTS)，研究了天然植物藥物在細(xì)胞培養(yǎng)模型上抑制錦鯉皰疹病毒復(fù)制的效果。藥物安全濃度試驗(yàn)結(jié)果表明，銀黃、黃芪多糖、板蘭根、炎琥寧以及穿心蓮對(duì)

6、錦鯉鰭條組織細(xì)胞的安全濃度分別為15.63mg/mL、2.5mg/mL、31.25mg/mL、31.25mg/mL和6.25mg/mL。在先給藥后感染試驗(yàn)組，銀黃、黃芪多糖、板藍(lán)根和炎琥寧的濃度分別為15.63mg/mL、2.5mg/mL、31.25mg/mL和6.25mg/mL時(shí)，有明顯的抑制KHV復(fù)制的效果，治療指數(shù)分別為22.88±3.26、21.07±4.86、24.76±3.24和18.20±2.78;穿心蓮抑制病毒復(fù)制的效果

7、不明顯。在先感染后給藥試驗(yàn)組，銀黃、板藍(lán)根和炎琥寧濃度分別在15.63mg/mL、31.25mg/mL和6.25mg/mL時(shí)有顯著抑制KHV增殖作用，治療指數(shù)分別為33.21±7.71、21.99±3.12和15.91±3.23。使用天然植物藥物處理病毒后再感染細(xì)胞，儀觀察到板藍(lán)根為濃度為31.25mg/mL時(shí)對(duì)KHV有較弱的直接殺滅作用，治療指數(shù)為5.7±1.62，而銀黃、黃芪多糖、穿心蓮和炎琥寧沒有直接殺滅KHV的效果。本研究的結(jié)果