引起雞與鵪鶉屬間雜交種性分化異常相關(guān)基因的研究.pdf

1、雞與鵪鶉屬間雜交是一類比較典型的遠(yuǎn)緣雜交，其雜交不育的一個(gè)重要表現(xiàn)是雜交種胚胎孵化早期死亡，死亡集中時(shí)間為3-5天，與其性分化時(shí)期吻合，已有研究證實(shí)雌激素受體（ER）在雜交種胚胎早期死亡中起著重要作用。ER的重要功能之一是調(diào)控雌激素的表達(dá)，在家禽中雌激素對(duì)性別分化起著調(diào)控作用，因此推斷雌激素對(duì)引起雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡有著重要的作用。家禽體內(nèi)雌激素的轉(zhuǎn)化需要羥基類固醇脫氫酶和17α羥化酶的作用，探明這些基因在雜交種胚胎孵化早期的

2、表達(dá)機(jī)制及胚胎早期死亡的關(guān)系，進(jìn)一步了解雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡的分子機(jī)制。 本研究在克隆鵪鶉和雜交種3β-HSD和P-450c17基因全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上，將這兩個(gè)基因定位于雞、鵪鶉和雜交種胚胎發(fā)育的早期，并進(jìn)行了相關(guān)基因的定量表達(dá)研究，結(jié)果如下： 1.鵪鶉及其屬間雜交種3β-HSD和P-450c17cds區(qū)全長(zhǎng)基因克隆和序列分析 對(duì)3p-HSD基因和P-450c17基因：雞的全長(zhǎng)序列已有報(bào)道，鵪鶉的報(bào)道了部

3、分序列，雜交種上國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究以鵪鶉及其雜交種早期胚胎為研究對(duì)象，利用RT-PCR和染色體步移技術(shù)，對(duì)3β-HSD和P-450c17基因序列進(jìn)行克隆測(cè)序及蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)，首次獲得了屬間雜交種3β-HSD cds的全長(zhǎng)序列1134bp（提交GenBank，ID為：FJ607243），鵪鶉3p-HSD cds的全長(zhǎng)序列（提交GenBank，ID為：FJ607242）；屬間雜交種P-450c17 cds全長(zhǎng)序列989bp（提交GenBa

4、nk，ID為：FJ607243）。結(jié)果表明：雞與雜交種的同源性較高，鵪鶉與雜交種的同源性較低。對(duì)兩個(gè)基因的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果分析，它們都可能是球狀蛋白。3p-HSD蛋白，雞與雜交種相似性較大，而鵪鶉與其它兩個(gè)差異較大；P-450c17蛋白，則表現(xiàn)為鵪鶉與雜交種相似性較大，而雞與其它兩個(gè)差異較大。 2. 3β-HSD、P-450c17在雞、鵪鶉及其屬間雜交種早期胚胎中的定位 3β-HSD和P-450c17作為ER的重要調(diào)控酶之

5、一，其具體表達(dá)部位在雞與鵪鶉雜交種上未見有報(bào)道。本研究以雞、鵪鶉及其雜交種早期胚胎為研究對(duì)象，通過(guò)整體原位雜交的方法，對(duì)3.5-5d的雞、鵪鶉及其雜交種早期胍胎的3β-HSD和P-450c17基因表達(dá)部位進(jìn)行定位檢測(cè)。結(jié)果表明：3β-HSD和P-450c17基因主要表達(dá)于性腺生殖嵴原基周圍。3β-HSD基因在雌性雜交種96h、102 h、108h的胚胎中存，即有表達(dá)，3β-HSD在雌性胚胎中表達(dá)信號(hào)較強(qiáng)，同時(shí)雄性胚胎在66-132h也有

6、表達(dá)；P-450c17基因在雌性雜交種96h、102h、108h胚胎中存在陽(yáng)性藍(lán)色信號(hào)，亦是有表達(dá)。同時(shí)研究結(jié)果表明3β-HSD在72h、84h和96h雌性胚胎心臟部位可能也有表達(dá)。 3.ER、3β-HSD和P-450c17基因在雞、鵪鶉及其屬間雜交種早期胚胎中的表達(dá)分析 本試驗(yàn)采集66-168h的雞、鵪鶉及其雜交種胚胎各5枚，采用Real-time PCR的方法獲得目的基因ER、3β-HSD和P-450c17在胚胎早期

7、mRNA表達(dá)豐度圖。 結(jié)果表明： 1.ER基因：雞在108h附近為表達(dá)高峰期；鵪鶉在96h之前表達(dá)不穩(wěn)定，至102h附近為表達(dá)高峰期；雜交種在72h附近出現(xiàn)一個(gè)較低的表達(dá)高峰期，之后開始下降，96h時(shí)再次出現(xiàn)一個(gè)較高的表達(dá)高峰期，由此可知，雞、鵪鵓和雜交種的ER在胚胎早期幾乎都存在兩個(gè)表達(dá)峰，其中雞與鵪鶉的表達(dá)峰為前高后低，而雜交種為前低后高。 2.P-450c17基因：雞在108h附近為表達(dá)高峰期；鵪鶉在96h

8、附近為表達(dá)高峰期；雜交種90h附近表達(dá)量達(dá)到高峰期。該基因在雜交種胚胎中的表達(dá)量較高，而鵪鶉的相對(duì)較低。 3.3β-HSD基因：雞在108h附近達(dá)到表達(dá)高峰期；鵪鵓在120h附近為表達(dá)高峰期；雜交種整體表達(dá)水平極低，大致可以看出在90h附近出現(xiàn)一個(gè)表達(dá)峰值，前后表達(dá)量變化差異不明顯。雞、鵪鶉及其雜交種三種基因的表達(dá)峰值都出現(xiàn)在90-108h，雜交種表現(xiàn)出較兩親本提前表達(dá)的趨勢(shì)；ER較3β-HSD、P-450c17基因提前表達(dá)，表