雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、雞和鵪鶉為家禽生產(chǎn)中的常見物種，雞與鵪鶉同種不同屬，其間雜交屬于禽類中的典型屬間遠緣雜交，是基因功能研究和比較基因組學的良好資源；而雞與鵪鶉雜交種在孵化過程中大量死亡，已有研究表明雜交種胚胎的死亡與胚胎組織器官發(fā)育不完全和性分化相關(guān)，而在胚胎發(fā)育、性別分化過程中參與的基因和信號通路眾多。本研究對雌、雄雞和雌、雄雜交種數(shù)字基因表達譜進行生物信息學分析篩選出與胚胎發(fā)育、性別分化相關(guān)基因，構(gòu)建基因過表達載體和 RNA干擾載體，以雞胚細胞為實驗

2、材料，調(diào)控目標基因表達量，利用實時熒光定量技術(shù)檢測相關(guān)基因表達變化，探索目標基因在表達異常時對胚胎發(fā)育的影響，為進一步研究雌性雜交種胚胎早期死亡的原因奠定基礎(chǔ)。
　　1.對雌雄雞與雌雄雜交種 DGE庫通過生物信息學分析篩選與胚胎發(fā)育、性分化相關(guān)顯著富集的信號通路，如 MPKA、Hedgehog、Wnt、Notch等；表達差異顯著的相關(guān)基因 FGF8、DACH、LFNG、SOX1、SOX2、SHH、FOXL2、GPR149、CCND

3、1。
　　2.差異基因 FGF8、SHH、FOXL2過表達載體和干擾載體的構(gòu)建，參照 NCBI上公布的原雞 FGF8、SHH基因 mRNA序列，在基因編碼區(qū)分別設(shè)計擴增全長引物，以 pEGFP-C2為載體，構(gòu)建雞 FGF8和 SHH基因過表達載體；經(jīng)菌液 PCR、酶切鑒定和測序驗證，過表達載體構(gòu)建成功。根據(jù) NCBI上公布的原雞 FGF8、SHH和 Foxl2基因的 mRNA序列，分別依據(jù)基因編碼區(qū)特點設(shè)計3對 shRNA干擾引物

4、，以 pmiRZip為載體，構(gòu)建靶向 FGF8、SHH、Foxl2基因干擾載體；經(jīng)測序驗證，干擾載體構(gòu)建成功。
　　構(gòu)建成功的 FGF8、SHH過表達載體和 FGF8、SHH、Foxl2干擾載體轉(zhuǎn)染雞胚細胞，驗證表達載體和干擾載體效果。
　　3.分析 FGF8、SHH、Foxl2基因?qū)ε咛グl(fā)育的影響，分別將 FGF8、SHH、FOXL2基因表達和干擾載體轉(zhuǎn)染雞胚細胞，檢測相關(guān)基因表達，實驗結(jié)果得出：當 FGF8基因表達量發(fā)生

5、變化時，在 MAPK信號通路中，細胞間的鏈接蛋白 Grb2表達水平降低，進而影響后續(xù)一系列信號傳遞與通路的激活，使胚胎不能正常生長發(fā)育。在 Hedgehog信號通路中，干擾 SHH基因的表達時 Hedgehog信號通路不能夠被激活而處于抑制狀態(tài)，使胚胎早期不能夠正常發(fā)育，當 SHH基因過表達時，能夠成功激活 Hedgehog信號通路，并且過度激活，同樣對胚胎產(chǎn)生負面影響，例如胚胎出現(xiàn)畸形。干擾 Foxl2基因使其表達量降低，造成胚胎發(fā)育