不同來源腸道沙門菌分離株流行病學(xué)分析及腸炎沙門菌macAB外排泵系統(tǒng)功能初步研究.pdf

1、沙門菌是最重要的食源性致病菌之一,能夠引起人和動(dòng)物發(fā)熱、腸炎、敗血癥等多種疾病。食物鏈中污染了沙門菌會(huì)帶來高昂的醫(yī)療費(fèi)用并且會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)力的降低,具有重要的經(jīng)濟(jì)影響。人類主要由于食用了污染的食物,尤其是動(dòng)物源性食品或者與患病動(dòng)物直接接觸而感染發(fā)病。近幾年來,由于抗生素在人和食源性動(dòng)物上大量使用和濫用,沙門菌的耐藥率正逐漸提高。已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道表明,從不同來源分離到的單重和多重耐藥沙門菌逐年增加,而且許多沙門菌的血清型中均出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)

2、象。這些耐藥的沙門菌能夠通過食物鏈傳遞至人類,從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
　　 細(xì)菌耐藥是由耐藥基因調(diào)控的。已知的許多耐藥基因大多位于可移動(dòng)元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和基因島上。在抗生素選擇性壓力的作用下,細(xì)菌能夠通過可移動(dòng)元件獲得耐藥基因,或者某些基因發(fā)生突變從而對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。多重耐藥細(xì)菌往往攜帶諸如整合子等基因元件。整合子位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和基因組上,它們可以整合并且傳播大量的耐藥基因。Ⅰ類整合子是最常見的整合子,研究

3、表明,在世界上許多國(guó)家的多種沙門菌血清型中均能檢測(cè)到Ⅰ類整合子。其主要由3部分組成,兩端為高度保守片段,即5'CS和3'CS,中間的可變區(qū)為含有一個(gè)或多個(gè)耐藥基因的基因盒,但是有的I類整合子不存在基因盒。
　　 細(xì)菌外排泵系統(tǒng)能夠通過膜通道蛋白外排多種抗菌藥物,在細(xì)菌耐藥性方面具有重要的作用。近年來的研究表明,除了在細(xì)菌耐藥性上發(fā)揮作用外,外排泵系統(tǒng)和許多細(xì)菌的毒力有關(guān)。AcrAB外排泵系統(tǒng)是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究較多的外排泵系統(tǒng),沙門

4、菌AcrAB外排泵系統(tǒng)和細(xì)菌多重耐藥及致病性有關(guān)。近來的研究顯示,macAB外排泵系統(tǒng)介導(dǎo)鼠傷寒沙門菌對(duì)紅霉素的耐藥性。而進(jìn)一步的研究表明,與其它外排泵分子的缺失株相比,macAB基因的缺失對(duì)鼠傷寒沙門菌的減毒作用最強(qiáng)。因此,有必要對(duì)腸炎沙門菌macAB外排泵系統(tǒng)在細(xì)菌耐藥和毒力方面的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 1不同來源腸道沙門菌分離株流行病學(xué)分析
　　 2009-2010年間,采集華東地區(qū)雞源、鴨源、鵝源、豬源和人源樣

5、品2566份,共分離到135株沙門菌,樣品陽性率為5.3％。135株沙門菌包括lO種不同的血清型,常見血清型依次為山夫登堡沙門菌、腸炎沙門菌、雞白痢沙門菌和鼠傷寒沙門菌。應(yīng)用XbaⅠ對(duì)所有分離株進(jìn)行PFGE分型分析,135株沙門菌共分為A-F6個(gè)遺傳譜系和47個(gè)PFGE帶型,相似度在36-100％之間。除了山夫登堡沙門菌、德爾卑沙門菌和圣保羅沙門菌外,PFGE帶型均按照血清型進(jìn)行遺傳譜系的劃分。有些分離于不同區(qū)域和不同動(dòng)物種類的紐波特沙

6、門菌相似度也非常高。PFGE結(jié)果表明,華東地區(qū)不同區(qū)域、不同源沙門菌和不同血清型沙門菌的PFGE帶型較復(fù)雜。
　　 對(duì)135株沙門菌分離株進(jìn)行了18種抗生素藥敏分析、17種耐藥基因和Ⅰ類整合子的檢測(cè)。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果表明,菌株對(duì)羧芐西林、萘啶酸、磺胺異噁唑、氨芐西林和阿莫西林的耐藥率最高,分別為94.1％、45.2％、37％、31.9％和28.9％,菌株對(duì)環(huán)丙沙星均敏感?？偣灿?31(97％)株菌株至少對(duì)1種抗生素耐藥。135株菌

7、株共有32種不同的耐藥譜。雞源沙門菌和雞白痢沙門菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,多數(shù)對(duì)5種及以上抗生素耐藥。
　　 耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果表明,blatem-1、blapse-1、sul2和tetA陽性率最高,分別為89.6％、55.6％、28.15％和20.7％,沒有檢測(cè)到blaCMY-2、blaCMY-9、tetC、tetG和flpR。除了氨基糖苷類外,其它種類抗生素耐藥表型的測(cè)定結(jié)果與耐藥基因基本一致。135株細(xì)菌中有17株攜帶Ⅰ類整合子

8、,陽性率為12.6％。含有Ⅰ類整合子菌株的血清型包括山夫登堡沙門菌、德爾卑沙門菌、雞白痢沙門菌和腸炎沙門菌。所有含有Ⅰ類整合子的菌株均攜帶int1和qacE△1-sulⅠ基因,其中有10株(7.4％)菌株含有大小為1 kb的整合子,其基因盒所含基因?yàn)閍adA2,含有大小為600 bp整合子的菌株不攜帶基因盒。另外,沒有在同一株菌株中發(fā)現(xiàn)有2種不同的Ⅰ類整合子。
　　 2腸炎沙門菌macAB外排泵系統(tǒng)功能初步研究以腸炎沙門菌人源分

9、離株P(guān)O4基因組為模板,PCR擴(kuò)增macAB基因的上下游同源臂,同時(shí)以質(zhì)粒pKD3為模板擴(kuò)增氯霉素耐藥基因Cm。將這3個(gè)基因亞克隆至自殺性載體pGMB151,構(gòu)建重組自殺性載體pGMB151-△macAB/Cm。通過重組自殺性載體pGMB151-△macAB/Cm突變的macAB基因和腸炎沙門菌PO4基因組上野生型macAB基因發(fā)生同源重組,成功構(gòu)建PO4△macAB缺失株。同時(shí)利用PCR方法對(duì)突變株進(jìn)行鑒定。突變株的血清型、生化特性及