艱難梭菌臨床分離株的分子流行病學(xué)及耐藥性研究.pdf

1、目的：艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種革蘭陽(yáng)性專性厭氧芽孢桿菌，通常在環(huán)境和人類腸道中正常存在。該菌由于產(chǎn)生毒素A、B而致病。過度應(yīng)用抗生素、免疫抑制劑或化療藥物使耐藥的艱難梭菌產(chǎn)毒株過度繁殖并釋放毒素是導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridium difficileassociated diarrhea，CDAD)的主要因素。CDAD的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加，尤其是高產(chǎn)毒株在北美地區(qū)造成了醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)

2、流行，引起了世界范圍的關(guān)注。所以，為了了解中國(guó)石家莊地區(qū)艱難梭菌的流行情況，我們對(duì)艱難梭菌臨床分離株的毒素基因、PCR-核糖體分型、耐藥性及耐藥相關(guān)基因進(jìn)行了一系列研究，為有效防止艱難梭菌的暴發(fā)流行提供依據(jù)。
　　方法：2010年7月至2011年12月期間，共收集來自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院的糞便標(biāo)本235份。首先，對(duì)這些標(biāo)本用糞便基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，采用常

3、規(guī)PCR的方法直接檢測(cè)糞便中艱難梭菌毒素A、B基因tcdA和tcdB；然后，對(duì)毒素陽(yáng)性的標(biāo)本通過富集芽孢培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)；最后，分離得到的艱難梭菌再通過多重PCR的方法同時(shí)檢測(cè)艱難梭菌毒素A、B基因tcdA和tcdB、二元毒素基因cdtA和cdtB及16SrDNA基因。用常規(guī)PCR的方法對(duì)分離到的艱難梭菌進(jìn)行PCR-核糖體分型，所得條帶用Quantity One軟件進(jìn)行比對(duì)分析。采用瓊脂稀釋法測(cè)定艱難梭菌對(duì)左氧氟沙星、萬古霉素、甲硝唑、克

4、林霉素、替加環(huán)素的最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)，并通過PCR的方法檢測(cè)克林霉素耐藥相關(guān)基因ermB。
　　結(jié)果：235份糞便標(biāo)本采用常規(guī)PCR的方法直接檢測(cè)糞便中艱難梭菌毒素A、B基因，共檢測(cè)出37份陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為15.7％。對(duì)37份PCR毒素陽(yáng)性的標(biāo)本用富集芽孢培養(yǎng)法進(jìn)行艱難梭菌培養(yǎng)，共培養(yǎng)出32株菌，培養(yǎng)陽(yáng)性率為86.5％。用多重PCR分別對(duì)分離出的32株菌進(jìn)行毒

5、素A、B(tcdA、tcdB)、二元毒素A、B(cdtA、cdtB)及16SrDNA檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)所有菌株的毒素A、B基因均陽(yáng)性，未檢出二元毒素基因。32株艱難梭菌分成12種不同的PCR核糖體型。其中SⅠ型最多，占28％，沒有發(fā)現(xiàn)核糖型027和078型。所有菌株對(duì)甲硝唑、萬古霉素、替加環(huán)素均高度敏感。但是對(duì)克林霉素(MIC>128mg/l)和左氧氟沙星(MIC>64mg/l)出現(xiàn)了高水平耐藥，并且耐藥率較高，分別為100％和87.5％。對(duì)美

6、洛培南的耐藥率較低為18.8％。32株對(duì)克林霉素耐藥的艱難梭菌中，檢出18株erml基因陽(yáng)性菌株，占56.25％。
　　結(jié)論：1用常規(guī)PCR的方法檢測(cè)艱難梭菌毒素A、B基因，可以對(duì)艱難梭菌感染行早期的診斷。2富集芽孢培養(yǎng)法，提高了艱難梭菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率，可作為一種有效的艱難梭菌培養(yǎng)方法在臨床推廣。3我國(guó)石家莊地區(qū)流行的32株艱難梭菌產(chǎn)毒株以A+B+的菌株為主，未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)二元毒素的菌株。4在該地區(qū)發(fā)現(xiàn)了12種不同的PCR核糖體型別，流行