萵苣和美麗異木棉的胚囊細(xì)胞分離.pdf

1、被子植物具有獨(dú)特的雙受精現(xiàn)象，姊妹精細(xì)胞中的一個(gè)與卵細(xì)胞結(jié)合發(fā)育成胚，另一個(gè)與中央細(xì)胞結(jié)合發(fā)育成胚乳。受精過程中，精細(xì)胞通過花粉萌發(fā)的花粉管進(jìn)入胚囊，繼而完成雙受精。整個(gè)受精過程都是在由體細(xì)胞組織形成的花柱、子房和胚珠內(nèi)完成。因而對(duì)于研究受精機(jī)理問題形成了障礙。將高等植物的精、卵細(xì)胞和其他胚囊細(xì)胞分離出來，在體外誘導(dǎo)精、卵融合及對(duì)人工合子和其他胚囊細(xì)胞的培養(yǎng)再生植株將可克服體細(xì)胞組織的障礙，從而進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的研究，達(dá)到揭示被子植物

2、受精機(jī)理的目的。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了萵苣和美麗異木棉兩種不同的植物作為研究材料，分別成功分離得到了一定數(shù)量的具有生活力的卵細(xì)胞、助細(xì)胞、中央細(xì)胞等胚囊細(xì)胞，以及合子、二胞原胚、四胞原胚等早期原胚細(xì)胞，為開展研究這兩種植物的受精機(jī)理掃清了主要障礙。
　　 1．萵苣胚囊細(xì)胞及早期原胚的分離：萵苣為一室子房，具有一個(gè)倒生胚珠，其胚囊成熟時(shí)只剩下4個(gè)胚囊細(xì)胞，包括一個(gè)卵細(xì)胞、兩個(gè)助細(xì)胞和一個(gè)中央細(xì)胞，反足細(xì)胞已完全退化。兩個(gè)助細(xì)胞極性

3、相同，有時(shí)還能觀察到絲狀器結(jié)構(gòu)，而中央細(xì)胞體積最大，因而很容易辨別出各個(gè)胚囊細(xì)胞的身份。根據(jù)萵苣的開花規(guī)律，選取了開花前一天，開花當(dāng)天及開花第二天的花，采用酶解——解剖的方法進(jìn)行分離。從開花前一天至開花第二天的花中均能分離出一定數(shù)目的卵細(xì)胞，但是卵細(xì)胞狀態(tài)表現(xiàn)出差異：隨著時(shí)間的向后延長(zhǎng)，卵細(xì)胞液泡化程度增加，極性愈強(qiáng)。開花第二天的花中已很少能分離出助細(xì)胞，推測(cè)已退化。而中央細(xì)胞在開花后6h的花中也很難分離出，可能已經(jīng)發(fā)生受精。從開花后6

4、h的花中分離得到合子，其體積與卵細(xì)胞相比明顯縮小，而且活性熒光分布均勻。在此基礎(chǔ)上，我們還進(jìn)一步分離出萵苣早期原胚細(xì)胞，包括二胞原胚，四胞原胚，五胞原胚及多細(xì)胞原胚。四胞原胚和五胞原胚的形成說明萵苣原胚階段細(xì)胞分裂方式的多樣性。萵苣卵細(xì)胞、助細(xì)胞、中央細(xì)胞、合子、二胞原胚、四胞原胚、五胞原胚和多細(xì)胞原胚的分離，為體外研究卵細(xì)胞至多細(xì)胞原胚的發(fā)育提供了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。分離得到的大量生活卵細(xì)胞還可為構(gòu)建萵苣卵細(xì)胞cDNA文庫、研究卵細(xì)胞發(fā)育

5、的分子生物學(xué)特性提供基本材料。
　　 2．美麗異木棉卵細(xì)胞和助細(xì)胞的分離：美麗異木棉為木本植物，花單生。實(shí)驗(yàn)中，我們采用酶解——解剖的方法成功分離得到大量的卵細(xì)胞和助細(xì)胞。美麗異木棉的卵細(xì)胞呈空泡狀，從胚囊釋放出來后極易飄至液面，而對(duì)其進(jìn)行FDA活性染色可以清楚地觀察到位于細(xì)胞周邊的細(xì)胞核，可能是受到大液泡的擠壓所致。對(duì)開花第一天至第四天花中分離的卵細(xì)胞體積進(jìn)行測(cè)量，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。將分離的卵細(xì)胞收集，進(jìn)行細(xì)胞和分子生物學(xué)方面