人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系異種種植研究及其腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、目的
　　1.探討人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系的生物學(xué)特性。
　　2.建立人淚腺腺樣囊性癌的動物模型，為研究淚腺腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展以及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和條件。
　　3.從人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系LACC中分離培養(yǎng)淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞，并對其特性進(jìn)行鑒定。
　　方法
　　1.實(shí)驗(yàn)第一部分:將人淚腺腺樣囊性癌(lacrimal adenoid cysticcarcinoma，LACC)細(xì)胞系接種于10只裸鼠腋下的

2、皮下，注射細(xì)胞懸液后每天觀察裸鼠并測量裸鼠荷瘤的最長徑L和最短徑W，并用公式V（荷瘤體積）=(L×W2)/2計算出荷瘤的體積。分別于注射細(xì)胞懸液后14天、28天、35天、42天、49天隨機(jī)取2只裸鼠的荷瘤以及裸鼠的肝臟、肺和腋下淋巴結(jié)。對注射細(xì)胞后14天的荷瘤行透射電鏡觀察，對注射細(xì)胞后14天、28天、35天、42天、49天的荷瘤行HE染色、免疫組織化學(xué)染色檢測Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100、Desmin的表達(dá)

3、以及提取其總RNA，用RT-PCR檢測該荷瘤的人類β-actin的表達(dá)情況。對所取的裸鼠肝臟、肺和腋下淋巴結(jié)組織切片，行HE染色，觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　2.實(shí)驗(yàn)第二部分:將LACC細(xì)胞消化、離心制成單細(xì)胞懸液，懸浮于無血清培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）中獲得腫瘤細(xì)胞微球體;應(yīng)用有限稀釋和單克隆形成實(shí)驗(yàn)確定該細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞的比例;MTT檢測腫瘤微球體的增殖能力以及其耐藥性;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)志C

4、D44+/CD24-在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況;向SFM中滴加含有血清培養(yǎng)基（serum supplied medium，SSM）誘導(dǎo)LACC腫瘤微球體分化，并觀察其形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果
　　1.接種細(xì)胞系后7天10只裸鼠腋下皮下全部長出荷瘤，成瘤率為100％。注射細(xì)胞懸液后14天取出的荷瘤呈圓形或橢圓形，表面可見包膜;不與周圍組織粘連;荷瘤質(zhì)地中等，剖面呈蒼白色。注射細(xì)胞懸液后49天的荷瘤表面仍可見包膜，荷瘤侵入裸鼠胸壁，甚

5、至侵入胸腔生長，但不與胸腔臟器粘連。
　　2.荷瘤的組織形態(tài)學(xué)及生物學(xué)行為觀察:1）HE染色觀察見荷瘤具有典型的上皮性腫瘤組織結(jié)構(gòu)。荷瘤以實(shí)體形為主，局部見粘液變、篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu);細(xì)胞為圓形或橢圓形，細(xì)胞邊界不太清楚，有豐富的粉染的胞漿，細(xì)胞核深染、大小差異明顯，可見瘤巨細(xì)胞，病理性核分裂常見。2）透射電子顯微鏡下觀察示荷瘤瘤細(xì)胞大小不等。相鄰細(xì)胞間以縫隙連接為主，偶見發(fā)育不良的橋粒，細(xì)胞表面有微絨毛，未見明確腺管形成。胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)

6、網(wǎng)輕度擴(kuò)張，散在線粒體，可見多聚核糖核蛋白體。有些腫瘤細(xì)胞胞漿中可見束狀微絲。核漿比例倒置，核形態(tài)不規(guī)則，核膜凹陷，可見多核仁，核周間隙擴(kuò)大。未見到典型核分裂相。
　　3)免疫組織化學(xué)染色示荷瘤對
　　Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100陽性表達(dá)， Desmin陰性表達(dá)。4）RT-PCR檢測荷瘤表達(dá)人類β-actin基因。5）光鏡下觀察，未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移至裸鼠肝臟、肺和腋下淋巴結(jié)。
　　3.LACC細(xì)

7、胞系中有(0.92±0.015)％的腫瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中能夠存活增殖形成自由漂浮的細(xì)胞微球體;微球體形狀規(guī)則，立體感強(qiáng)，球體內(nèi)細(xì)胞排列緊密，富有折光性，并可穩(wěn)定傳代。與貼壁細(xì)胞相比，LACC腫瘤微球體具有更強(qiáng)的體外增殖能力、對順鉑具有更強(qiáng)的耐藥性。流式細(xì)胞儀表面標(biāo)志檢測，LACC細(xì)胞CD44+/CD24-比率為23.77％，而LACC腫瘤微球體CD44+/CD24-比率為84.25％。在含血清環(huán)境下LACC腫瘤細(xì)胞微球體可分化為貼壁

8、生長的單層細(xì)胞，與SSM中培養(yǎng)的LACC細(xì)胞無明顯差異。
　　結(jié)論
　　1.人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系(LACC)具有一般惡性腫瘤的特點(diǎn)，同時也具有腺樣囊性癌細(xì)胞的特點(diǎn)。荷瘤具有與原瘤一致的組織學(xué)特性，該動物模型易復(fù)制，時間短，成功率高，是研究淚腺腺樣囊性癌的良好模型，為研究該腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療途徑提供了一個極為有用的工具。
　　2.用含有生長因子的SFM懸浮人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系LACC可獲得淚腺腺樣囊性癌腫瘤細(xì)胞微