人胚胎干細(xì)胞系與人孤雌胚胎干細(xì)胞系建立的研究.pdf

1、目的：胚胎干細(xì)胞是一類來源于哺乳動物原始生殖細(xì)胞和囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的全能細(xì)胞，主要具有兩方面顯著特征:一是具有體外高度增殖和自我更新的能力，二是可被定向誘導(dǎo)分化成體內(nèi)各種細(xì)胞類型。孤雌激活來源的人胚胎干細(xì)胞的基因型與卵子提供者的基因型完全相同，由其誘導(dǎo)分化的細(xì)胞用于機(jī)體移植完全不會引起免疫排斥。因此，人胚胎干細(xì)胞尤其是人孤雌胚胎干細(xì)胞具有巨大的醫(yī)學(xué)研究價值與應(yīng)用前景，如再生醫(yī)學(xué)、人類發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞治療等。本實驗旨在建立穩(wěn)定的、標(biāo)準(zhǔn)化的人胚

2、胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，并且在保證人胚胎干細(xì)胞長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，比較不同飼養(yǎng)層對維持人胚胎干細(xì)胞生長的作用影響，從而優(yōu)化人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件。與此同時，對培養(yǎng)體系進(jìn)行改良，利用廢棄卵母細(xì)胞獲得的孤雌囊胚在改良的完全人源性培養(yǎng)條件下建立最接近臨床標(biāo)準(zhǔn)的人孤雌胚胎干細(xì)胞系，為臨床級人孤雌胚胎干細(xì)胞研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　對象與方法：本實驗收集天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心試管嬰兒治療患者的不成熟卵母細(xì)胞和移植后剩余無凍存價

3、值的廢棄胚胎，征得患者夫婦雙方同意并簽署知情同意書后用于本實驗。應(yīng)用人包皮成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，85％KnockOut DMEM、15％KnockOut血清替代物、4ng/mlbFGF培養(yǎng)基，建立人胚胎干細(xì)胞系，并且對其特異性標(biāo)志物SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，堿性磷酸酶，體內(nèi)或體外分化能力作全面的鑒定。同時，對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、人包皮成纖維細(xì)胞、人胚胎肺組織成纖維細(xì)

4、胞三種飼養(yǎng)層的形態(tài)、性狀、維持人胚胎干細(xì)胞生長能力如干細(xì)胞平均克隆形成數(shù)量、未分化克隆率進(jìn)行比較，篩選出本實驗室條件下最適合的人胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層，并且應(yīng)用這種飼養(yǎng)層細(xì)胞建立人孤雌胚胎干細(xì)胞系。應(yīng)用不成熟人卵母細(xì)胞作為研究對象，體外培養(yǎng)成熟后，采用電脈沖聯(lián)合6-DMAP孤雌激活及自發(fā)激活獲得孤雌囊胚，同時改良人孤雌胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)體系，完全應(yīng)用人源性培養(yǎng)基、人源性飼養(yǎng)層細(xì)胞，并且在操作中盡量減少異源性因素干擾，使建立的人孤雌胚胎干細(xì)胞系最

5、大可能接近臨床級應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：利用本實驗室建立的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法和改良的同源性培養(yǎng)體系，分別建立了人胚胎干細(xì)胞系H-TJ1、H-TJ2和人孤雌胚胎干細(xì)胞系P-TJ，體外長期擴(kuò)增均超過30代，經(jīng)鑒定分別保持人胚胎干細(xì)胞和人孤雌胚胎干細(xì)胞的特性。接種在三種飼養(yǎng)層上的人胚胎干細(xì)胞均可以維持克隆樣生長，生物學(xué)鑒定均符合人胚胎干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，但不同飼養(yǎng)層上克隆的形態(tài)差異大。相比于兩種人來源飼養(yǎng)層，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為經(jīng)典的飼養(yǎng)層可

6、以獲得最多的人胚胎干細(xì)胞克隆，而作為同源性飼養(yǎng)層細(xì)胞，人包皮成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層明顯優(yōu)于另兩種飼養(yǎng)層細(xì)胞，能很好地維持人胚胎干細(xì)胞增殖和未分化狀態(tài)。
　　結(jié)論：本研究成功建立了人胚胎干細(xì)胞和人孤雌胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系，應(yīng)用廢棄胚胎和經(jīng)體外成熟的M1、GV期卵母細(xì)胞分離得到了人胚胎干細(xì)胞系和人孤雌胚胎干細(xì)胞系，并且維持其人胚胎干細(xì)胞特性和人孤雌胚胎干細(xì)胞特性。人包皮成纖維細(xì)胞作為同源性飼養(yǎng)層細(xì)胞，不僅可以避免異源性污染并且可以維持人胚胎干