豬程序性死亡因子1的克隆鑒定以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染對PD-1-PD-L通路的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染豬不僅天然免疫應答微弱，病毒特異性獲得性免疫應答也出現(xiàn)遲且弱。PRRSV感染引起的免疫抑制是造成PRRSV持續(xù)性感染的主要原因。目前對于PRRSV引起的免疫抑制機理已經(jīng)從病毒和宿主兩方面都進行了廣泛的研究，但從宿主效應細胞的角度進行的研究比較少。PD-1/PD-L通路主要調控機體獲得性免疫應答水

2、平，在許多人類疾病中證實與免疫逃避和持續(xù)性感染密切相關。本研究旨在克隆豬的PD-1基因，并研究PRRSV感染后對PD-1/PD-L通路的影響，為進一步探討PD-1/PD-L通路與PRRSV的持續(xù)性感染之間的關系奠定基礎。
　　 通過同源性搜索在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到了一條與人PD-1分子同源性較高的豬的EST序列。根據(jù)該序列設計引物，從豬PBMC中經(jīng)RT-PCR擴增獲得了該基因。測序表明，豬PD-1基因長867bp，編碼28

3、8個氨基酸，與人和小鼠PD-1分子的氨基酸序列同源性分別為63％和54％，并且具有相似的分子結構包括信號肽和跨膜區(qū)兩個疏水性區(qū)域和一個胞外區(qū)以及一個胞內區(qū)，且一些功能性的氨基酸和基序在三個種屬間非常保守。為了驗證豬PD-1能夠與PD-L1結合，將豬PD-1的完整編碼區(qū)克隆到pcDNA3.1載體中，轉染293T細胞，用真核表達的可溶性蛋白PD-L1-Fc與轉染細胞進行作用，通過流式細胞儀檢測證實克隆的PD-1分子可以與已報道的豬的PD-L

4、1結合。利用偽型逆轉錄病毒將克隆的PD-1基因轉導豬PBMC，在體外用抗豬CD3分子的抗體刺激T細胞增殖時加入PD-L1-Fc融合蛋白，通過流式細胞儀檢測進一步證實豬PD-1與PD-L1的相互作用可以抑制T細胞增殖和細胞因子分泌，說明豬PD-1分子與人和小鼠的PD-1分子一樣是一個具有免疫負調控作用的協(xié)同刺激分子。
　　 針對豬PD-1、PD-L1和PD-L2基因序列分別設計了特異性引物和TaqMan探針，以系列稀釋的重組質粒p

5、MD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2為標準品，進行實時熒光定量PCR條件優(yōu)化，建立了檢測這三個基因的熒光定量RT-PCR方法。結果表明。建立的方法在1×102-1×108copies/μL模板范圍內具有良好的線性關系，相關系數(shù)r2在0.99以上，擴增效率均高于96％，可檢測至少100 copies的陽性標準品。對豬PBMC上這三個基因的表達情況進行檢測表明該方法敏感性高、特異性強、重復性好，可應用于臨床樣品的檢測。

6、r>　　 將豬PD-1基因和PD-L1基因的胞外區(qū)分別克隆到原核表達載體pGEX-6p-1和pET32a上進行了表達。豬PD-1的胞外區(qū)以包涵體的形式表達，而PD-L1的胞外區(qū)為可溶性表達。將表達的蛋白純化后免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術獲得了1株針對豬PD-1分子的單抗和2株針對PD-L1分子的單抗，并對這些單抗進行了Western blot分析和流式細胞儀檢測，證實這些單抗不僅可以識別原核表達的變性蛋白，也可以識別真核細胞表

7、面表達的膜型蛋白。
　　 利用上面建立的檢測方法對PRRSV感染后效應細胞和靶細胞上PD-1及其配體的表達變化進行了監(jiān)測。首先用PRRSV感染體外培養(yǎng)的原代PAM細胞，在感染后不同時間點收集細胞，利用熒光定量RT-PCR方法，以CyPA作為內參，比較感染細胞與正常培養(yǎng)細胞中PD-L1和PD-L2的表達變化。結果表明，PRRSV在感染后24h PD-L1的表達開始上調，與正常細胞相比上調了2.2倍，至感染后60h，上調倍數(shù)達到6倍

8、左右。但PD-L2的表達幾乎沒有變化。通過對培養(yǎng)上清中的病毒毒價進行測定發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達水平與病毒的復制水平之間呈正相關，說明PRRSV感染可以引起PD-1的配體PD-L1的表達量增加。然后用PRRSV感染40日齡仔豬，在感染后不同時間點采集PBMC，對PD-1的表達變化進行了監(jiān)測。檢測方法為相對熒光定量RT-PCR（以CyPA作為內參）和流式細胞術。利用熒光定量RT-PCR檢測的結果表明，PRRSV感染豬PBMC中PD-1的表達在

9、感染后3天就開始上調，與對照豬相比上調了約3倍，在感染后7-10天達到高峰，上調倍數(shù)約5倍左右。通過流式細胞儀檢測PD-1的表達變化與熒光定量RT-PCR結果一致，在感染后7-14天，感染豬PBMC中CD4+T細胞和CD8+T細胞上PD-1的表達與對照豬相比都上調了2-3倍，至感染后35天，少數(shù)存活豬PD-1表達水平仍較高。利用熒光定量PCR檢測方法對血漿中病毒載量進行了檢測。通過將病毒載量與PD-1表達水平進行比較發(fā)現(xiàn)，二者之間呈正相