PD-1-PD-L信號通路對人心房顫動免疫調(diào)控的研究.pdf

1、心房顫動（AtrialFibrillation,AF）是臨床最常見的心律失常，然而，房顫的病理生理機制卻沒有完全闡明。目前，越來越多的證據(jù)支持免疫炎癥反應(yīng)和房顫的發(fā)病機理有關(guān)，研究證明C反應(yīng)蛋白（CRP）和白介素-6（IL-6）等血漿炎癥因子和抗M2毒蕈堿受體等自身抗體在房顫患者大量增加，活化的T淋巴細胞在房顫患者心肌內(nèi)膜浸潤。然而，目前尚無充分的證據(jù)能完全闡明此免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控的分子機制。
　　T細胞活化需要經(jīng)典的雙信號作用。

2、第一信號來自抗原與受體結(jié)合，即T細胞受體（TCR）與抗原肽（MHC分子復(fù)合物）結(jié)合時，抗原識別信號可通過CD3分子傳入胞內(nèi)。第二信號來自協(xié)同刺激信號，抗原提呈細胞（APC）或靶細胞與T細胞之間輔助分子作用可作為T細胞活化的第二信號。第一信號分子標志物有CD69和人類白細胞抗原-DR（HLA-DR）等，CD69是II型跨膜糖蛋白，是淋巴細胞早期活化標志，HLA-DR是主要組織相容性復(fù)合物（MHC）II類分子，在抗原提呈和輔助激活T淋巴細胞

3、中起作用，屬于后期淋巴細胞活化標志。該分子的高表達提供第一信號調(diào)控T細胞反應(yīng)的激活。
　　B7：CD28家族在調(diào)節(jié)T細胞活化或耐受的過程中提供第二信號，其不僅提供積極的第二個信號，維持和促進T細胞的反應(yīng)，也能提供關(guān)鍵負性的第二信號，下調(diào)T細胞的反應(yīng)，促進免疫耐受，因此，其被認為在免疫活化過程中起關(guān)鍵的平衡作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，B7：CD28家族有很多抑制T細胞活化的通路，近年發(fā)現(xiàn)的程序性死亡因子-1（PD-1）及配體（PD-L）通

4、路由于獨特抑制功能備受關(guān)注。PD-1主要與APC表面的PD-L結(jié)合發(fā)揮抑制T細胞活化功能，干擾素α、β和γ是PD-L1表達的上調(diào)因子，其可促進PD-L1在抗原提呈細胞上表達明顯增加。目前，PD-1/PD-L信號通路被認為在T細胞反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其在自身免疫性疾病和感染性疾病中得到了廣泛研究。PD-L由于其在心血管系統(tǒng)的高表達，也被認為在心血管疾病中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，目前，PD-1/PD-L信號通路在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病

5、、自身免疫性心肌炎和自身免疫性擴張型心肌病的作用已有研究。然而，PD-1/PD-L信號通路是否參與了房顫的發(fā)生發(fā)展，目前尚無報道，T細胞活化是否參與房顫的發(fā)病機理也不十分明確。
　　本研究以房顫患者為研究對象，以流式細胞術(shù)檢測外周血CD69和HLA-DR在CD3+T淋巴細胞上的表達水平；PD-1在CD4+和CD8+T淋巴細胞上的表達水平；PD-L在髓系樹突狀細胞（mDCs）、巨噬細胞、CD4+和CD8+T淋巴細胞上的表達水平；以流

6、式技術(shù)CBA法檢測血漿IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ炎性細胞因子濃度。分析CD69、HLA-DR、PD-1/PD-L和炎性細胞因子在房顫患者外周血的表達特點及其表達水平的高低與細胞免疫活性之間的關(guān)系。體外淋巴細胞混合增殖實驗檢測PD-L水平的改變對T細胞增殖和細胞因子分泌的影響，進一步研究α干擾素上調(diào)PD-L1在mDCs表達后對免疫活性的影響，以期闡明CD69、HLA-DR和PD-1/PD-L

7、信號通路在房顫發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，從而為房顫的病理生理機制提供新的理論依據(jù)。為此，本研究主要完成以下工作：
　　1.收集和分析外周血T細胞表面CD69和HLA-DR的表達特點
　　按入選標準篩選我科確診的房顫病人，分為陣發(fā)性房顫組和持續(xù)性房顫組，另選取無心律失常發(fā)作的自愿者為對照組，收集其外周靜脈血，整理相關(guān)臨床資料，利用流式細胞儀檢測患者CD3+T細胞表面CD69和HLA-DR的表達水平，分析其表達特點。
　　

8、2.血PD-1和PD-L的表達特點分析
　　利用流式細胞儀檢測患者CD4+、CD8+T細胞表面PD-1表達水平，mDCs、巨噬細胞、CD4+細胞和CD8+T細胞上的PD-L1及PD-L2的表達水平，分析其表達特點。
　　3.IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ細胞因子濃度特點分析
　　利用流式細胞術(shù)CBA法檢測患者血漿IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和

9、IFN-γ細胞因子濃度，分析其特點。
　　4.PD-1/PD-L信號通路對房顫患者T淋巴細胞免疫功能的影響
　　分離外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞及mDCs，用房顫組和對照組的mDCs與另一個健康人的CD4+或CD8+T細胞混合培養(yǎng)，行同種異體淋巴細胞增殖實驗，采用[3H]-TdR摻入法檢測mDCs刺激T細胞增殖能力，及對IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ細胞因子分泌的影響。使用

10、α干擾素上調(diào)PD-L1在mDCs上的表達，研究PD-L1表達上調(diào)對mDCs刺激T細胞增殖能力及細胞因子分泌能力的影響。
　　結(jié)果
　　1.CD69和HLA-DR在房顫患者外周血中CD3+T細胞上表達水平明顯增加。2.PD-1在房顫患者CD4+T細胞上表達水平明顯下調(diào)，其受體PD-L1在mDCs上的表達水平也顯著下調(diào)，且持續(xù)性房顫患者較陣發(fā)性房顫患者下調(diào)更明顯。
　　3.房顫組患者的IL-2、IL-6、IL-10和IFN

11、-γ血漿濃度明顯升高，持續(xù)性房顫患者較陣發(fā)性房顫患者更明顯，IL-4、IL-17A和TNF血漿濃度和對照組無明顯差異。
　　4.淋巴細胞增殖實驗顯示，房顫患者mDCs刺激異源性T細胞增殖及細胞因子分泌能力比對照組明顯升高，α干擾素上調(diào)mDCs的PD-L1表達后，其刺激異源性T細胞增殖及細胞因子分泌能力明顯降低。
　　結(jié)論
　　1.PD-1/PD-L1路徑通過CD4+T細胞/mDCs作用參與房顫的免疫調(diào)控，PD-1/PD