豬DDX3X的功能分析及其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的影響.pdf

1、DDX3X是含DEAD-box家族的RNA解旋酶成員之一。DEAD-box解旋酶參與許多的生物學(xué)過程,如:調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、RNA剪切、核運(yùn)輸、控制mRNA的翻譯等。研究表明DDX3X參與天然免疫應(yīng)答,增強(qiáng)抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生；另一方面,DDX3X有可能是病毒達(dá)到天然免疫逃避的目的的手段之一。
　　 PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒,屬于動脈炎病毒科屬,引起PRRS,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失。生產(chǎn)有效的PRRSV疫苗是養(yǎng)豬業(yè)迫切的需求

2、。目前還不清楚豬DDX3X的功能及其對PRRSV增殖的影響,鑒于此,本研究主要是分析豬DDX3X的功能及其對PRRSV增殖的影響,主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.豬DDX3X基因的擴(kuò)增、序列分析、及進(jìn)化樹的繪制
　　 通過對豬基因EST數(shù)據(jù)庫的分析,設(shè)計特異性引物,PK-15細(xì)胞RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增獲得豬DDX3X基因序列。分析發(fā)現(xiàn)豬DDX3X的核苷酸序列全長為1986bp,編碼662個氨基酸,與鼠、人、牛、雞、

3、日本血吸蟲的氨基酸序列同源性分別為97％、97％、98％、90％、53％,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析雖然表明不同物種DDX3X的氨基酸序列存在一定差異,但是DDX3X在進(jìn)化上還是比較保守的,并且豬DDX3X與牛DDX3X的親緣關(guān)系最近。
　　 2.豬DDX3X的亞細(xì)胞定位
　　 將豬DDX3X基因插入真核表達(dá)載體pEGFP-C2中構(gòu)建豬DDX3X與EGFP融合的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-DDX3X,轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)豬DD

4、X3X主要定位于胞漿,沒有發(fā)現(xiàn)豬DDX3X在細(xì)胞核中的定位。
　　 3.豬DDX3X參與IFN-β誘導(dǎo)
　　 以豬DDX3X的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HA-DDX3X轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,通過熒光定量檢測證實豬DDX3X能上調(diào)IFN-β-mRNA水平的表達(dá)。進(jìn)一步利用豬DDX3X的干擾分子sipDDX3X干擾細(xì)胞內(nèi)源性豬DDX3X的表達(dá),檢測豬DDX3X對SeV/poly(dA:dT)誘導(dǎo)IFN-β的影響,結(jié)果豬DDX3

5、X的敲除明顯下調(diào)SeV/poly(dA:dT)誘導(dǎo)的IFN-βmRNA水平。利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)證實豬DDX3X能顯著激活I(lǐng)FN-β啟動子。
　　 4.豬DDX3X以劑量依賴的形式促進(jìn)TBK1/IPS-1激活I(lǐng)FN-β啟動子
　　 利用紅熒光蛋白和綠熒光蛋白作標(biāo)記證實豬DDX3X與TBK1/IPS-1在PK-15細(xì)胞中均存在共定位現(xiàn)象,由此說明豬DDX3X與TBK1/IPS-1存在相互作用。進(jìn)一步利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)

6、證實豬DDX3X促進(jìn)TBK1/IPS-1激活I(lǐng)FN-β啟動子,并呈劑量依賴的形式,也進(jìn)一步證實了豬DDX3X與TBK1/IPS-1存在相互作用。
　　 5.豬DDX3X與PRRSV的相互作用
　　 將pEGFP-C2-DDX3X真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞,然后接種PRRSV,DAPI染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察證實PRRSV感染不改變豬DDX3X在Marc-145細(xì)胞中的定位。在SJPL細(xì)胞中瞬時表達(dá)豬DDX3