豬繁殖與呼吸綜合征病毒編碼蛋白對TLR3和IL-10表達(dá)的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV可通過多種途徑宿主逃避免疫應(yīng)答，包括調(diào)節(jié)IL-10、抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能和抑制Ⅰ型干擾素（IFN-α/β）產(chǎn)生等，從而導(dǎo)致病毒持續(xù)感染，但其分子機(jī)制尚不十分清楚。為了探究PRRSV編碼蛋白對TLR3和IL-10表達(dá)影響，本研究構(gòu)建了PRRSV部分非結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，證明Nsp1和Nsp11可以抑制TLR3啟動子活性，初步探索了其

2、可能機(jī)制;同時還構(gòu)建了PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，證明GP5和N蛋白可以誘生IL-10表達(dá);另外，還構(gòu)建了Nsp4，Nsp7，Nsp12的真核表達(dá)質(zhì)粒，觀察了其作為基因疫苗的免疫特性。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.PRRSV3個非結(jié)構(gòu)蛋白對TLR3啟動子活性的影響及其機(jī)理
　　PRRSV ORF1a和ORF1b可以翻譯形成14個病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，其中部分非結(jié)構(gòu)蛋白具有抑制Ⅰ型干擾素活性的功能。TLR3是先天性免疫中重要的受體

3、分子，它經(jīng)dsRNA刺激后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素和促炎癥因子，啟動先天性免疫反應(yīng)。為了探究PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白對TLR3轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，本研究構(gòu)建了PRRSV BB0907毒株Nsp1，Nsp1α、Nsp1α-Δ14、Nsp1β、Nsp7和Nsp11蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)，檢測了以上各蛋白對TLR3啟動子活性的影響，發(fā)現(xiàn)Nsp1、Nsp1α和Nsp1β具有抑制TLR3啟動子活性的能力，并且Nsp1α的C端鋅指結(jié)構(gòu)是其抑制

4、活性所必須的。同時，Nsp11也具有抑制TLR3啟動子活性的能力，并且呈劑量依賴關(guān)系;而且，Nsp11能夠顯著的抑制INF-β誘導(dǎo)下的TLR3啟動子活性，表明Nsp11可能具有抑制JAK-STAT通路的活性。此結(jié)果在一定程度上解釋了PRRSV易造成宿主先天性免疫低下原因，并為后續(xù)研究Nsp11的免疫抑制機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　2.PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)及其對IL-10啟動子活性的影響
　　PRRSV可以通過誘導(dǎo)IL-10

5、的產(chǎn)生來抑制免疫應(yīng)答，造成持續(xù)性感染。為了探究PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白對IL-10的誘生能力，本研究首先構(gòu)建了PRRSV BB0907毒株各結(jié)構(gòu)蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并在BHK-21細(xì)胞中利用間接免疫熒光的方法鑒定了其表達(dá)，再利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)，在PAM(3D4/2)細(xì)胞中檢測其對IL-10啟動子的激活能力。結(jié)果顯示，GP5和N蛋白都能夠顯著性的激活I(lǐng)L-10的啟動子，此為后續(xù)研究PRRSV誘生IL-10的具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　

6、　3.PRRSV Nsp4、Nsp7和Nsp12基因疫苗的構(gòu)建及其免疫特性研究
　　豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起豬的一種高度傳染性疾病，為了有效控制該病，人們一直致力于通過篩選更有效的靶抗原來研制新型的PRRSV疫苗。然而現(xiàn)階段，對靶抗原的篩選主要集中在PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白上，對非結(jié)構(gòu)蛋白的研究相對較少。為了探究PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白作為免疫保護(hù)抗原的可行性，本研究選取了PRRSV BB090毒株