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文檔簡介
1、據(jù)稱,內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)是遠古反轉(zhuǎn)錄病毒感染時留下的痕跡,構(gòu)成了機體“virome”的重要組成部分。過去對內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的功能不夠了解,曾將其視為“垃圾DNA”(Junk DNA)。但最近有研究表明,某些內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒不僅對早期胚胎發(fā)育和胚胎干細胞的多能性具有重要作用,還可能與病毒感染、天然免疫以及抗腫瘤作用有關(guān)。本研究選擇內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒一雞內(nèi)源性白血病病毒(Avianle
2、ukosis virus subgroup E,ALVE)作為研究模型,應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對雞1號染色體上存在的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1進行去表達以探索其與天然免疫之間的關(guān)系,為進一步研究內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的功能和作用奠定基礎(chǔ)。
本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)將轉(zhuǎn)錄終止序列(SV40 ployA)敲入內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1的啟動子區(qū),通過終止其轉(zhuǎn)錄從而實現(xiàn)ALVE1的去功能(Loss of functio
3、n)。本文不僅成功構(gòu)建了針對家禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒去功能研究的新方法,還為今后研究內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的功能提供了新思路。主要的研究結(jié)果如下:
1、ALVE1的鑒定及轉(zhuǎn)錄表達分析:首先,應用反式PCR(Inverse PCR)與cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù),成功鑒定了ALVE1在雞1號染色體的具體位置信息,獲得了完整的ALVE1序列。然后,將ALVE1序列分成
4、三部分,分別設(shè)計引物進行PCR擴增,結(jié)果顯示:在雞巨噬細胞系HD11中含有完整的ALVE1序列,而在雞成纖維細胞系DF-1中缺乏ALVE1序列。最后,通過PCR鑒定ALVE1在HD11中的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明: ALVE1的四個區(qū)域(即LTR、gag、pol和env)在雞巨噬細胞系HD11中均能轉(zhuǎn)錄表達。
2、轉(zhuǎn)錄終止元件的篩選:為了篩選高效的轉(zhuǎn)錄終止序列,本研究構(gòu)建了含有轉(zhuǎn)錄終止序列以及綠色熒光蛋白GFP的載體,通過對GFP熒
5、光的觀察以及熒光定量PCR檢測,分別比較SV40 polyA、4×SV40 polyA、β-globin和β-globin△5-7四個轉(zhuǎn)錄終止序列的終止效率。結(jié)果顯示:四個轉(zhuǎn)錄終止序列都有較高的終止活性,其終止效率均高于90%。在四個終止序列中,由于SV40 polyA的序列最短,本文最終選定SV40 polyA作為本研究的終止元件。在此基礎(chǔ)上,本文還繼續(xù)探索了正向與反向SV40 polyA的終止效率,結(jié)果表明:正向與反向的SV40 p
6、olyA均有轉(zhuǎn)錄終止活性,但是反向序列的終止活性遠低于正向序列。
3、CRISPR/Cas9介導的ALVE1轉(zhuǎn)錄終止及其功能初探:為了實現(xiàn)ALVE1去功能以研究其與天然免疫之間的關(guān)系,本文構(gòu)建了含有轉(zhuǎn)錄終止序列的同源重組載體,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將其敲入ALVE1的啟動子區(qū),然后通過嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)雙篩選,最終獲得了ALVE1被終止轉(zhuǎn)錄的雞巨噬細胞系(命名為:HD11-ALV
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