A亞群禽白血病病毒gp85囊膜蛋白原核表達(dá)及初步應(yīng)用.pdf

1、A亞群禽白血病(Avian leukosis，AL)是由A亞群禽白血病病毒(ALV-A)引起的傳染性腫瘤病病，可造成感染雞群的免疫力下降、產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)降低、生長遲緩等。該病在我國雞群中廣泛流行，對我國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重威脅。我國政府和科技工作者對該病高度重視，采取凈化種雞群、阻斷垂直傳播的防控策略來控制該病。由于缺乏針對ALV-A特異性診斷試劑和疫苗抗原，限制了對該病的凈化檢測和疫苗防治的研究。本研究利用ALV-A gp85基因進(jìn)行了A亞

2、群單克隆抗體的制備與ALV-A基因工程亞單位疫苗抗原的免疫保護(hù)作用評價試驗，為建立ALV-A特異性診斷方法和探索新型防治方法提供科學(xué)依據(jù)。
　　ALV-A gp85基因的克隆與表達(dá)。根據(jù)已發(fā)表基因序列，設(shè)計引物，從感染ALV-A-SDAU09C1病毒的DF1細(xì)胞中獲得病毒全基因組DNA，以此為模板擴(kuò)增獲得大小為909bp的gp85目的基因，利用該基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pET32a-SDAU09C1-gp85)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得

3、高效表達(dá)的大小約為46KD的目的蛋白;該蛋白經(jīng)純化、乳化后制備成免疫抗原。
　　ALV-A gp85重組蛋白抗原的免疫保護(hù)性研究。將純化后的gp85重組蛋白與不同佐劑（弗氏佐劑和CpG佐劑）進(jìn)行乳化、混合，制備ALV-A免疫原，免疫60周齡農(nóng)大三號種母雞，首次免疫后每隔3周進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，于首免后每周檢測血清ALV-A抗體，并與卵黃抗體比較分析。對種雞進(jìn)行人工授精，收集受精種蛋、孵化，對孵化的1日齡雛雞進(jìn)行攻毒。攻毒后4周對雛雞

4、進(jìn)行病毒血癥、泄殖腔棉拭子p27進(jìn)行檢測，并觀察雞只狀態(tài)及統(tǒng)計死亡率，同時進(jìn)行血清抗體病毒中和試驗。結(jié)果顯示:(1)使用ALV-A gp85重組蛋白與不同佐劑可以誘導(dǎo)全部種雞產(chǎn)生較高效價的血清抗體和卵黃抗體，其中CpG佐劑聯(lián)合免疫組效果優(yōu)于其它免疫組。(2) gp85聯(lián)合CpG佐劑組與對照組相比，雛雞的病毒血癥、泄殖腔排毒率和死亡率均顯著降低。(3)體外病毒中和試驗表明，誘導(dǎo)產(chǎn)生的雛雞體內(nèi)母源抗體可以中和ALV-A病毒，其中和作用與抗體

5、滴度高低呈現(xiàn)正相關(guān);免疫熒光分析(IFA)試驗證實抗體與病毒的結(jié)合。
　　ALV-A單克隆抗體的制備。以制備的gp85重組蛋白抗原免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，三次加強(qiáng)免疫后制備脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合、篩選，獲得一株分泌抗ALV-A抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為A14GZ。對該單抗進(jìn)行ELISA效價測定、IFA和免疫組化方法鑒定，結(jié)果顯示:(1) ELISA法測定的細(xì)胞上清效價為1∶26，腹水效價為1∶213;(2) IFA鑒定

6、顯示該單抗能特異性識別ALV-A病毒;不與ALV-J、ALV-B結(jié)合(3)取已知感染ALV-A病毒雞只的心肌組織，制作切片，并作A亞群單克隆抗體介導(dǎo)的IFA檢測，可見心肌細(xì)胞質(zhì)特異性綠色熒光。
　　以上結(jié)果表明，利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功的獲得了具有良好免疫原性的ALV-A gp85重組蛋白，聯(lián)合佐劑能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生的較高ALV-A血清抗體和母源抗體，對后代雛雞具有較好的抗ALV-A早期感染的作用，保護(hù)率可達(dá)80％。同時，利用ALV-A