J亞群禽白血病病毒受體的分離鑒定及研究.pdf

1、禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)可以致禽發(fā)生多種類型的腫瘤，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒。根據(jù)病毒囊膜蛋白的抗原性，分為A-J等10個(gè)亞群，其中A，B，C，D，E和J亞群能夠感染雞。J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)是1980年代由Payne等[1]人從肉雞中首次分離鑒定。
　　反轉(zhuǎn)錄病毒env囊膜蛋白含有兩個(gè)表面亞單位:一個(gè)是SU蛋白(surface

2、 unit，SU)，另外一個(gè)是TM蛋白。SU蛋白含有病毒-受體相互作用的決定簇，能夠介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合，是決定宿主范圍的關(guān)鍵因素，病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合是啟動(dòng)病毒感染的第一步，也是最為關(guān)鍵的一步。病毒粒子一旦與受體結(jié)合，即會(huì)激活病毒與細(xì)胞的融合[2]。
　　在反轉(zhuǎn)錄病毒中，目前已被鑒定的病毒受體已有很多。例如，貓免疫缺陷病毒(FelineImmunodeficiency Virus，F(xiàn)IV)利用CD4和CD134作為感染

3、宿主細(xì)胞的主要受體[1];人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)利用CD4、CCR5和CXCR4分別作為主要受體和共受體[2]感染人CD4 T細(xì)胞;同時(shí)，CD4、CCR5和CXCR4亦作為猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)的受體參與SIV的感染過程[3]。然而，SIV卻廣泛地使用各種共受體分子介導(dǎo)病毒感染，例如:CCR1、CCR2b、CCR3、

4、CCR8、GPR1、GPR15以及其他多種細(xì)胞因子受體[4]。這些病毒受體的鑒定為深入研究、了解病毒感染機(jī)制和為人類控制疾病發(fā)揮了很好的作用。
　　到目前為止，禽白血病病毒受體分離鑒定研究中，已有四種受體蛋白得到鑒定，分別是Tva, Tvb，Tvc和chNHE1。其中，Tva, Tvc和chNHE1分別介導(dǎo)A亞群[5],C亞群[6]和J亞群[7]禽白血病病毒的感染，而Tvb負(fù)責(zé)編碼B亞群，D亞群[8]和E亞群[9]禽白血病病毒受體

5、。禽白血病病毒曾經(jīng)作為分析病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的模型用于病毒感染研究[10]，發(fā)揮了很好的作用。然而，本世紀(jì)初禽白血病尤其是J亞群禽白血病的感染發(fā)生很大變化，尤其是在中國出現(xiàn)嚴(yán)重問題，ALV-J從肉用雞群發(fā)展到蛋雞群[11]，中國的一些地方品種雞群也可以感染;由單獨(dú)引起病雞發(fā)生髓細(xì)胞瘤、血管瘤發(fā)展至可同時(shí)引起病雞的血管瘤、髓細(xì)胞瘤，甚至引發(fā)病雞同時(shí)產(chǎn)生血管瘤、髓細(xì)胞瘤和平滑肌瘤[12];近幾年，相繼有報(bào)道指出ALV-J在雞體內(nèi)與其他免疫抑制

6、病毒（如MDV[13]、REV[14]）發(fā)生共感染現(xiàn)象。這些現(xiàn)象的發(fā)生一方面可能是由于在自然選擇壓下，env基因可變區(qū)的快速變異或基因重組導(dǎo)致病毒毒力和致瘤性的增強(qiáng)以及宿主感染范圍的擴(kuò)大，但更重要的可能是在病毒的感染上存在新的受體。當(dāng)然，ALV-J gp85基因序列不同程度的變異也可能會(huì)導(dǎo)致ALV-J的組織嗜性和細(xì)胞受體類型發(fā)生變化，繼而影響到宿主的范圍。
　　為此，本研究利用J亞群禽白血病病毒為模型，通過免疫共沉淀、質(zhì)譜分析、熒

7、光定量PCR等技術(shù)進(jìn)行了ALV-J新受體的分離鑒定和特性分析。
　　1.ALV-J gp85基因和兔IgG Fc基因在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中的融合表達(dá)
　　首先將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的SUJ-rIgGFc基因克隆進(jìn)pShuttle-CMV載體中，構(gòu)建腺病毒重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-SUJ-rIgGFc;重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1感受態(tài)細(xì)胞，在感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)與腺病毒骨架pAdEasy-1同源重組及抗性篩選獲得重組

8、腺病毒質(zhì)粒pAd-SUJ-rIgGFc;重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SUJ-rIgGFc經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞獲得重組腺病毒rAd-SUJ-rIgGFc。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和免疫熒光試驗(yàn)(FA)分析并證明目的基因SUJ-rIgGFc通過腺病毒表達(dá)載體在293T細(xì)胞中得到很好地表達(dá)，且融合蛋白主要分布于293T細(xì)胞膜，可被ALV-J特異性單克隆抗體JE9和羊抗兔IgG所識(shí)別;Westernblot試驗(yàn)結(jié)果表明，融合蛋白大小在90

9、-95kd左右，與JE9以及羊抗兔IgG均有很好的反應(yīng)性。同時(shí)，將重組病毒感染MDCK細(xì)胞，利用免疫熒光試驗(yàn)分析，表明重組病毒能夠感染MDCK細(xì)胞，融合蛋白在MDCK細(xì)胞中表達(dá)良好。本研究利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)在人293T細(xì)胞成功融合表達(dá)了ALV-J gp85基因和兔IgG Fc基因，獲得了能夠表達(dá)目的基因的重組病毒;同時(shí)，通過MDCK擴(kuò)增重組病毒，收獲并純化融合蛋白，為下一步分離ALV-J受體提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.J亞群禽

10、白血病病毒受體的分離鑒定和質(zhì)譜分析
　　利用DF1細(xì)胞系和pcDNA-env DF1細(xì)胞系作為受體供體細(xì)胞，為免疫共沉淀試驗(yàn)提供目的蛋白，同時(shí)采用兩種方案進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。方案一，將DF1細(xì)胞膜蛋白與融合蛋白SUJ-rIgGFc、protein A agarose進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)，沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和銀染后，切膠并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。方案二，pcDNA-env DF1細(xì)胞經(jīng)裂解后分離膜蛋白，與抗ALV-Jenv蛋白單克隆抗體

11、JE9、protein A agarose resin進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)，沉淀洗脫蛋白經(jīng)SDS-PAGE和銀染后，切膠，進(jìn)行質(zhì)譜分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示，兩種方案獲得的免疫共沉淀產(chǎn)物中均得到約80kd和38kd的兩個(gè)蛋白條帶。經(jīng)質(zhì)譜分析，這兩種蛋白分別是78kd葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated Protein，GRP78)和膜聯(lián)蛋白A2（annexin，ANXA2）。提示，本研究分離的能夠與ALV-J SU蛋白特

12、異結(jié)合蛋白是ALV-J疑似受體，為進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證疑似受體奠定了基礎(chǔ)。
　　3.GRP78和ANXA2在J亞群禽白血病病毒感染中的功能分析
　　通過抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗在DF1細(xì)胞中進(jìn)行感染抑制試驗(yàn)，以檢驗(yàn)GRP78和ANXA2在J亞群禽白血病病毒粒子進(jìn)入靶細(xì)胞或在早期感染過程中是否發(fā)揮著受體的功能。首先，利用抗GRP78和抗ANXA2多抗封閉DF1細(xì)胞表面GRP78和ANXA2，然后用ALV-J感染DF1細(xì)胞

13、，并用甘氨酸處理滅活細(xì)胞外的病毒粒子，48小時(shí)后通過間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)、熒光定量PCR分別檢測細(xì)胞中ALV-J env的表達(dá)水平，同時(shí)通過測定細(xì)胞上清中的ALV-J的TCID50鑒定病毒效價(jià)，從而判定抑制病毒感染的效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)多抗封閉的DF1細(xì)胞中ALV-J env的表達(dá)水平均有所下降。病毒滴度測定結(jié)果顯示，當(dāng)抗體濃度達(dá)到50μtg/mL時(shí)，抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗對(duì)病毒感染的抑制率分別可達(dá)到93.2％和

14、98.4％; IFA和Western blot結(jié)果顯示，隨著阻斷抗體濃度的加大，DF1細(xì)胞中ALV-J env蛋白表達(dá)越來越少，病毒滴度也顯著降低，而作為對(duì)照，抗體對(duì)ALV-A的感染無抑制作用。結(jié)果表明，病毒感染所需的受體被特異性抗體所封閉，啟動(dòng)病毒感染的第一步即病毒與受體的結(jié)合被有效阻斷，從而導(dǎo)致病毒感染率的下降。本研究中，細(xì)胞表面GRP78和ANXA2的缺失是導(dǎo)致ALV-J感染率的急劇下降甚至出現(xiàn)ALV-J的感染失敗的根本原因，表明

15、GRP78和ANXA2是ALV-J的受體。
　　4.J亞群禽白血病病毒受體chGRP78和chANXA2重建試驗(yàn)
　　chGRP78和chANXA2作為J亞群禽白血病病毒受體，能夠介導(dǎo)ALV-J進(jìn)入宿主細(xì)胞從而啟動(dòng)病毒感染。那么，如果在非易感細(xì)胞表面建立同樣的受體模型，ALV-J是否還能感染非易感細(xì)胞？或者，chGRP78和chANXA2是否還具有介導(dǎo)ALV-J進(jìn)入非易感細(xì)胞的功能？為此，本研究利用人胚腎細(xì)胞（HEK293T

16、細(xì)胞）和鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)作為受體重建靶細(xì)胞，以DF1細(xì)胞總RNA為模板擴(kuò)增chGRP78和chANXA2基因全序列，并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-chGRP78和pcDNA3.1-chANXA2。chGRP78和chANXA2分別或共同轉(zhuǎn)染GEF或293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)候后感染ALV-J(M.O.I=5)，并于感染后不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞，通過間接免疫熒光試驗(yàn)或熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)ALV-J env的表達(dá)。ALV-

17、J(M.O.I=5)感染表達(dá)chGRP78和/或chANXA2的GEF細(xì)胞，病毒吸附2小時(shí)候甘氨酸(Ph3.0)滅活未進(jìn)入細(xì)胞的病毒粒子，48小時(shí)候收獲GEF細(xì)胞并裂解，將細(xì)胞裂解物接種DF1細(xì)胞，培養(yǎng)7天后，利用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測病毒增殖情況。IFA結(jié)果顯示，共表達(dá)chGRP78和chANXA2的GEF細(xì)胞以及表達(dá)chANXA2的GEF細(xì)胞裂解物接種的DF1細(xì)胞均能產(chǎn)生可見的特異性熒光，而表達(dá)chGRP78或空載體的GEF

18、細(xì)胞裂解物接種的DF1細(xì)胞未見特異性熒光，說明chANXA2和chGRP78在GEF細(xì)胞中的表達(dá)有效地介導(dǎo)并協(xié)助了病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞，完成了病毒感染關(guān)鍵的第一步;而在兩個(gè)受體之間，chANXA2應(yīng)該較chGRP78承擔(dān)著更為主要的作用或角色。
　　同時(shí)，表達(dá)chGRP78或chANXA2的293T細(xì)胞在感染ALV-J后，通過real-time PCR檢測感染后12h、24h、48h和72h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)293T細(xì)胞內(nèi)ALV-J env基

19、因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，表達(dá)chGRP78或chANXA2的293T細(xì)胞內(nèi)ALV-J env基因的相對(duì)表達(dá)水平相對(duì)空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞要高得多。在感染后48小時(shí)內(nèi)，表達(dá)chGRP78的293T細(xì)胞中ALV-J env基因的相對(duì)表達(dá)水平出現(xiàn)上升，并于48小時(shí)達(dá)到最高值;表達(dá)chANXA2的293T細(xì)胞中ALV-J env基因的相對(duì)表達(dá)水平在72h出現(xiàn)持續(xù)上升趨勢;而共表達(dá)chGRP78和chANXA2的293T細(xì)胞中env的相對(duì)表

20、達(dá)水平亦呈現(xiàn)上升趨勢，并在48h達(dá)到最高。研究結(jié)果表明，chGRP78和chANXA2在293T細(xì)胞中獲得表達(dá)，且ALV-J env的mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的過程，說明ALV-J病毒粒子確實(shí)能夠借助293T細(xì)胞表面表達(dá)的chGRP78或chANXA2進(jìn)入細(xì)胞，證明兩種蛋白對(duì)介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞確實(shí)發(fā)揮了重要作用;而比較293T細(xì)胞的熒光定量PCR結(jié)果可見，與chGRP78相比較，chANXA2在病毒感染中應(yīng)該發(fā)揮著更為主要的作用。