布魯氏菌中CRISPRi與CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建及功能驗(yàn)證.pdf

1、布魯氏菌病(brucellosis)是一種波及世界的重要的人畜共患病，對(duì)畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)樗诵蠊不疾〉奶攸c(diǎn)，也使其成為了人類(lèi)健康和社會(huì)安全的一大威脅。然而，迄今為止，都未能研發(fā)出安全有效的疫苗。布魯氏菌(Brucella)，又稱(chēng)作布氏桿菌，是造成布魯氏菌病的病原體，要研發(fā)出安全有效的疫苗，對(duì)該菌各類(lèi)基因的功能研究是十分重要的。
　　目前，對(duì)布魯氏菌基因的功能研究存在許多困難。一是布魯氏菌生長(zhǎng)緩慢，在實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定的培養(yǎng)

2、環(huán)境下，菌體需要生長(zhǎng)36-48h才能在平板上長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落。初次分離的野生菌株生長(zhǎng)往往更加緩慢。二是布魯氏菌病人畜共患的特征，使得對(duì)布魯氏菌的操作變的相當(dāng)繁瑣和耗時(shí)。這些因素都使得對(duì)布魯氏菌基因的研究變得格外困難。目前，對(duì)布魯氏菌基因功能的研究主要是依靠自殺質(zhì)粒，通過(guò)單交換和雙交換建立基因缺失株，再通過(guò)對(duì)基因缺失株的研究探索基因功能。但是，該方法耗時(shí)長(zhǎng)，操作量大，大大增加了科研人員的操作風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也減緩了研究進(jìn)度。所以，在布魯氏菌中

3、創(chuàng)建一類(lèi)迅速、精準(zhǔn)、有效的基因研究方式是具備重要意義的。
　　CRISPRi與CRISPR/Cas9系統(tǒng)，是近年發(fā)展迅速的領(lǐng)先的基因研究方法。由于其快速、精確、高效的基因編輯效果，馬上成為眾多科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。當(dāng)前已普遍用在對(duì)多種生物的研究中。
　　為此，本研究中，我們研究了CRISPRi與CRISPR/Cas9系統(tǒng)在布魯氏菌中應(yīng)用的可行性。首先，我們建立了可在布魯氏菌中復(fù)制表達(dá)的CRISPRi工作質(zhì)粒。CRISPRi系統(tǒng)由

4、兩個(gè)重要部分組成，具有阻遏目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄功能的dCas9蛋白和具有目標(biāo)基因識(shí)別功能的sgRNA。本研究中，我們以布魯氏菌外膜蛋白基因ompl9為靶基因設(shè)計(jì)sgRNA，對(duì)omp19的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，評(píng)估了CRISPRi系統(tǒng)在布魯氏菌中對(duì)基因表達(dá)下調(diào)的作用。此外，我們又建立了可在布魯氏菌中復(fù)制表達(dá)的CRISPR/Cas9工作質(zhì)粒，并利用該表達(dá)系統(tǒng)嘗試對(duì)布魯氏菌omp19基因進(jìn)行敲除。主要成果如下:
　　1.利用CRISPRi系統(tǒng)使布魯氏菌

5、外膜蛋白基因omp19表達(dá)下調(diào)，且下調(diào)具有顯著性。
　　成功構(gòu)建2種可以在布魯氏菌中復(fù)制的CRISPRi工作質(zhì)粒，分別通過(guò)組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)的形式表達(dá)dCas9蛋白。設(shè)計(jì)sgRNA，靶定下調(diào)omp19基因。將CRISPRi工作質(zhì)粒轉(zhuǎn)化布魯氏菌16M感受態(tài)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析該基因在mRNA水平的表達(dá)，通過(guò)western blot的方法分析該基因在蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，omp19基因表達(dá)量下調(diào)，并具有顯著性。

6、　　2.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功切割布魯氏菌基因組。
　　成功建立了在布魯氏菌中誘導(dǎo)型表達(dá)wtCas9蛋白的CRISPR/Cas9工作質(zhì)粒。設(shè)計(jì)sgRNA，在omp19基因上對(duì)布魯氏菌基因組進(jìn)行切割。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至布魯氏菌16M感受態(tài)，結(jié)果顯示CRISPR/Cas9成功地切斷布魯氏菌基因組。
　　3.增強(qiáng)了布魯氏菌通過(guò)非同源末端連接途徑(non-homologous end joining，NHEJ)的基因修復(fù)功能