基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的水稻重要基因定點(diǎn)編輯技術(shù)研究.pdf

1、水稻是全世界食用人數(shù)最多的糧食作物，隨著世界人口不斷增長，水稻增產(chǎn)和品質(zhì)性狀的改良日益成為育種家們關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)育種手段基于雜交育種，耗時(shí)長且依賴育種家經(jīng)驗(yàn)，難以滿足性狀定向改良需求；物理、化學(xué)、航天誘變和生物等技術(shù)手段很難做到定點(diǎn)突變；轉(zhuǎn)基因手段尚未得到廣泛認(rèn)可；傳統(tǒng)基因定點(diǎn)突變技術(shù)技術(shù)過程復(fù)雜且難以廣泛應(yīng)用，因此，迫切需求建立安全、高效的目的基因定向改良技術(shù)流程，實(shí)現(xiàn)品種直接改良并提供可供育種利用的新種質(zhì)。近年來，以CRISPR/

2、Cas9技術(shù)為代表的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)成為植物育種技術(shù)的研究新熱點(diǎn)，這為水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新提供了安全、高效的新途徑。CRISPR/Cas9技術(shù)只需設(shè)計(jì)一段與靶點(diǎn)配對的含20個(gè)堿基的核苷酸序列，操作簡單，實(shí)驗(yàn)周期短，費(fèi)用低，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物和動(dòng)植物的基因編輯中，但目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻基因編輯上的研究和應(yīng)用還不夠。
　　本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)編輯控制水稻千粒重基因TGW6和水稻堊白性狀基因

3、Chalk5，初步建立了基于 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的水稻基因定點(diǎn)編輯技術(shù)平臺(tái)，建立了穩(wěn)定可靠的水稻農(nóng)藝性狀關(guān)鍵基因突變方法技術(shù)體系，并創(chuàng)制了一些具有重要價(jià)值的非轉(zhuǎn)基因水稻新種質(zhì)和供水稻基礎(chǔ)研究的突變體，為重大水稻新品種的培育和基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。主要研究成果如下：
　?。?）成功構(gòu)建四靶點(diǎn)pLY CRISPR/Cas9-TGW6、pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1和pLY CRISPR/

4、Cas9-Chalk5-2雙元表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得一定數(shù)量的水稻H447、S95B和02428組培苗T0代。
　?。?）組培苗T0代打靶效果檢測，同個(gè)靶點(diǎn)在不同水稻和不同基因中突變效率并不十分一致，差別較大，且四靶點(diǎn)并不全部發(fā)生突變，統(tǒng)計(jì)顯示 T2靶點(diǎn)突變率最高?；駾NA序列突變類型主要有堿基缺失、錯(cuò)配和插入，其中以堿基缺失和錯(cuò)配為主。
　?。?）將pLY CRISPR/Cas9-TGW6載

5、體轉(zhuǎn)入秈稻S95B、pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1載體轉(zhuǎn)入秈稻S95B與H447和pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-2載體轉(zhuǎn)入粳稻02428當(dāng)中，成功獲得組培苗，分別獲得轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株為18、13、8和10株，其中發(fā)生突變植株分別有18、13、7和9株突變，突變率87.5-100％，發(fā)生雙等位突變分別有6、4、4和5株，純合突變分別有11、9、3和4株，雜合突變1株。
　?。?）對四個(gè)突變體株系

6、進(jìn)行相應(yīng)表型鑒定，結(jié)果顯示突變后代突變效果差異較大，相同基因系列發(fā)生突變后并沒有出現(xiàn)一致性的改變。轉(zhuǎn)pLY CRISPR/Cas9-TGW6載體秈稻S95B突變體植株千粒重表型鑒定顯示較對照變化不大，只有1株千粒重22.78g大于對照7.09%，其它均低于對照組。轉(zhuǎn)pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-1載體S95B和H447，堊白性狀鑒定結(jié)果表明，其堊白度基本表現(xiàn)為高于對照組，H447陽性株系堊白度最高達(dá)到19.44%，明顯高

7、于堊白度1.96%的對照組，S95B陽性株系堊白度最高達(dá)到28.91%，明顯高于堊白度2.80%的對照組。轉(zhuǎn)pLY CRISPR/Cas9-Chalk5-2載體02428突變植株，堊白度性狀基本表現(xiàn)為低于對照組，陽性株系堊白度最低達(dá)到61.29%，明顯低于堊白度84.00%對照組。
　?。?）初步建立了一整套基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)編輯水稻基因的技術(shù)體系，規(guī)范和完善了水稻突變體基因鑒定和表型鑒定技術(shù)流程，初步建立了基于C