煙粉虱CRISPR-Cas9系統(tǒng)的建立及其在BtTRP基因溫度耐受性功能驗(yàn)證中的應(yīng)用.pdf

1、由于全球氣候的不斷變化，生物入侵的過程和結(jié)果也面臨著復(fù)雜的變化。煙粉虱的入侵機(jī)制與其對溫度的適應(yīng)性有很大關(guān)系。煙粉虱之所以能在全世界范圍內(nèi)迅速擴(kuò)散并成為重要害蟲，其關(guān)鍵因素之一就是對溫度變化的抵抗力很強(qiáng)。煙粉虱的耐高溫和耐低溫的能力都很強(qiáng)，即使在炎熱或寒冷的季節(jié)也能猖獗，造成危害。隨著環(huán)境的變化，動(dòng)物體中的很多細(xì)胞表面受體和離子通道感受器都會(huì)做出相應(yīng)的反應(yīng)，影響動(dòng)物的行為。其中，昆蟲對外界環(huán)境溫度的感知就與瞬時(shí)感受器陽離子通道( tra

2、nsient receptor potential, TRP)有關(guān)。TRP是一種位于細(xì)胞膜上的非選擇性陽離子通道跨膜蛋白質(zhì)，當(dāng)其被激活時(shí)，允許包括鈣離子在內(nèi)的陽離子進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。其中TRP中的TRPA亞家族對于生物體對溫度感知和適應(yīng)有很重要的作用，推測是入侵粉虱適應(yīng)不同環(huán)境溫度并廣泛擴(kuò)散暴發(fā)的重要基礎(chǔ)。本試驗(yàn)室之前通過飼喂BtTRP基因dsRNA的方法，揭示了BtTRP基因在煙粉虱溫度耐受性中起了關(guān)鍵作用。但若持續(xù)抑制 BtTRP基因是

3、否也對煙粉虱溫度耐受性產(chǎn)生影響需要進(jìn)一步開展研究。
　　本研究探索了一種簡單高效的試驗(yàn)方法，即通過 CRISPR/Cas9系統(tǒng)來誘導(dǎo)煙粉虱的基因突變，明確煙粉虱 BtTRP基因在溫度感受方面的功能并探究CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)基因突變的可遺傳性。文中闡述了向煙粉虱MED隱種紅眼期偽蛹注射靶基因sgRNA和Cas9 mRNA，高效誘導(dǎo)靶標(biāo)基因發(fā)生突變，并檢測雜交后代是否有突變表型的試驗(yàn)過程。結(jié)果表明，注射后的煙粉虱對外界溫度變

4、化敏感度顯著下降，從而不能進(jìn)行溫度適應(yīng)性調(diào)節(jié)，導(dǎo)致對高低溫環(huán)境的耐受性下降。并經(jīng)雜交檢測，證實(shí)這些突變可通過種系遺傳給后代。此系統(tǒng)相對于其他的誘導(dǎo)基因突變方法具有更高的效率和更廣泛的應(yīng)用。主要研究結(jié)果：
　　（1）通過對煙粉虱MED隱種紅眼期偽蛹顯微注射靶基因sgRNA和Cas9 mRNA，干擾 BtTRP基因的正常表達(dá)，羽化后得到注射型煙粉虱。以高溫?fù)舻箷r(shí)間作為煙粉虱耐熱性表型，擊倒時(shí)間越長，耐熱性越強(qiáng)；以低溫脅迫處理后的恢復(fù)時(shí)

5、間作為耐寒性的表型，恢復(fù)時(shí)間越短，耐寒性越強(qiáng)。得出結(jié)論：注射型煙粉虱和野生型的耐熱/寒表型值之間存在顯著差異，野生型對高低溫脅迫的耐受性明顯高于注射型，說明BtTRP基因在煙粉虱感知外界溫度方面有重要作用；
　　（2）通過兩種雜交手段：一是將注射煙粉虱和未注射煙粉虱進(jìn)行雜交，得到F1代；二是將F1自交，得到后代F2。對親本F0、F1、F2代樣本進(jìn)行檢測，分別在同一世代的不同雜交組合之間進(jìn)行比較，在同一雜交組合的不同世代之間進(jìn)行比較