黃斑藍(lán)子魚血清抗寄生蟲及細(xì)菌活性物質(zhì)的研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文黃斑藍(lán)子魚血清抗寄生蟲及細(xì)菌活性物質(zhì)的研究姓名：王方華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：水生生物學(xué)指導(dǎo)教師：謝明權(quán)20100608中山大學(xué)博士學(xué)位論文蛋白對(duì)刺激隱核蟲具有殺滅效果。另外，采用超濾、反相高效液相色譜和N a t i v e ．P A G E的純化方法，同樣也分離到了一種有抗菌效果的蛋白。綜合蛋白分子量測(cè)定、W c s t c m雜交及蛋白功能相互驗(yàn)證的結(jié)果表明這兩種純化方法所得的蛋白為同一種蛋白組分。生理狀態(tài)下，

2、該蛋白以帶兩個(gè)正電荷的陽(yáng)離子形式存在，并且是以相同單體構(gòu)成的多聚體的形式發(fā)揮功能，質(zhì)譜分析其單體的精確分子量為6 1 7 3 9 ．8 7 1D a 。N 端1 5 個(gè)氨基酸的序列為：S S V E K N L 認(rèn)C L 砌) N D 。蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)行肽指紋譜分析發(fā)現(xiàn)其與日本鯖中報(bào)道的L ．氨基酸氧化酶具有高度的相似性，結(jié)合N 端測(cè)序的結(jié)果，可基本確定該活性蛋白為一種L 氨基酸氧化酶。純化蛋白A P P 在刺激隱核蟲上作用位點(diǎn)

3、的亞細(xì)胞定位觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該蛋白對(duì)刺激隱核蟲的作用效果，并闡明了該蛋白是通過與蟲體的細(xì)胞膜和細(xì)胞核相互作用而使蟲體細(xì)胞破裂的機(jī)制來(lái)殺死蟲體的。A P P 對(duì)于刺激隱核蟲的最小殺蟲濃度為0 ．0 8 8 m g ／m l 。利用純化蛋白A P P 測(cè)定其對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小殺菌濃度分別為5 ．4 9 3 9 9 ／m l 和0 ．3 5 2 m g ／m l 。利用純化的蛋白A P P 所制備的多克隆抗體對(duì)該蛋白在魚體

4、的組織分布進(jìn)行研究，結(jié)果表明該蛋白在脾臟、腎臟、鰓和血液中表達(dá)量較多，而在腦、肝臟、肌肉、心臟、小腸中則未檢測(cè)到有表達(dá)。根據(jù)已報(bào)道的幾種魚類L 廣氨基酸氧化酶的基因進(jìn)行相似性比對(duì)，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)了兩對(duì)簡(jiǎn)并引物，并通過P C R 擴(kuò)增到了一個(gè)1 1 0 3 b p 的基因序列。分析發(fā)現(xiàn)其所編碼蛋白中的某些肽段與質(zhì)譜所測(cè)定的A P P 部分多肽片段具有較高的匹配度，初步證明該基因即為編碼所分離到的純化蛋白A P P 的基因。相似性比對(duì)結(jié)果表