熱休克蛋白同源物Hsc70等5種基因在蛻皮激素信號途徑中的功能及相互作用研究.pdf

1、昆蟲的蛻皮和變態(tài)受20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和倍半萜類保幼激素(iuvenile hormone,JH)的雙重作用。20E起始了蛻皮生理過程,而保幼激素則決定著蛻皮的性質(zhì)。20E通過和蛻皮激素受體(ecdysteroid receptor,EcR)結(jié)合,再與超氣門蛋白(ultraspiracle protein,USP)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,繼而起始了蛻皮級聯(lián)反應(yīng),一些早期的蛻皮受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子開

2、始轉(zhuǎn)錄,包括EcR、USP、E74、E75以及激素接受子3(HR3)。隨后,激素信號途徑中的若干晚期基因被誘導表達,從而介導了蛻皮進程。保幼激素是一種調(diào)控昆蟲生活史的關(guān)鍵激素,在維持蛻皮期間的幼蟲狀態(tài)和引導昆蟲的生殖成熟方面發(fā)揮了重要作用。保幼激素可能通過與其可能受體Met相結(jié)合來調(diào)控幼蟲的生長發(fā)育。
　　 EcR/USP轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中還有伴侶蛋白參與,如熱休克蛋白Hsp90和熱休克蛋白同源物Hsc70是該異源復(fù)合物的組成部分,伴

3、侶蛋白與EcR/USP形成的異源復(fù)合物對于EcR/USP的DNA結(jié)合活性的發(fā)揮是必不可少的。但對伴侶蛋白如何調(diào)控EcR/USP的DNA結(jié)合活性的分子機制并不清楚。
　　 本文鑒定了一個新的棉鈴蟲表皮細胞系,建立了可被激素誘導和可進行RNA干擾的細胞系模型。在此基礎(chǔ)上檢測了一系列受20E調(diào)控的基因的表達模式。借助細胞系RNAi鑒定了蛻皮激素受體EcRB1和超氣門蛋白USP1及熱休克蛋白同源物Hsc70在20E信號途徑中的功能及作用

4、機理。此外,還鑒定了兩個受20E上調(diào)的激酶(鳥苷酸激酶和腺苷酸激酶1),為研究20E信號途徑提供了有效的分子靶標。
　　 1.棉鈴蟲表皮細胞系鑒定及蛻皮激素誘導模型和RNA干擾模型的建立
　　 通過標記基因鑒定了HaEpi為表皮細胞系。棉鈴蟲表皮細胞系HaEpi由本實驗室邵紅蓮建立,該論文的工作是用各種標記基因鑒定細胞系,證明其沒有其它組織污染。研究結(jié)果表明,兩種表皮蛋白(Ha-cup1和Ha-cup4)與Ha-tryp

5、sin2在表皮組織和表皮細胞系中表達,但在血淋巴中無表達。相反,Ha-cathL在血淋巴中特異表達,但在表皮細胞和其它三種組織中無表達。在細胞系上未檢測到在中腸組織特異表達的hmg176和在脂肪體中特異表達的hexamerine。這些結(jié)果表明該HaEpi系的基因表達模式與表皮組織一致,但不同于血細胞、中腸和脂肪體,說明HaEpi系確屬表皮組織來源的表皮細胞系。
　　 建立了在JaEpi系上進行20E誘導和進行RNA干擾的方法。N

6、orthern blot結(jié)果表明,非甾醇類的20E類似物RH-2485處理后的細胞中蛻皮激素信號途徑中的標記分子HHR3的表達量上調(diào)。HHR3的主帶在處理后3小時內(nèi)就開始表達,12小時后達到最高峰,然后逐漸下降,而其他三條帶的表達相對較弱。當我們用HHR3的雙鏈RNA轉(zhuǎn)染細胞沉默HHR3后,RT-PCR結(jié)果顯示HHR3的表達量顯著降低。這些結(jié)果表明HaEpi是一個可被20E誘導和可進行RNA干擾的細胞系。這為我們利用RNAi檢測基因的功

7、能提供了一個良好的實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 利用該可誘導的細胞系模型檢測了20E對一系列基因表達的調(diào)控。這些基因包括HaEcRB1,HaUSP1,E74A,E75B,HHR3,ecdysteroid-regulated gene(ecdy),carbA2,nuclear transfer factor2(NTF2),gamma subunit of guanine nucleotide binding protein(G-pro-γ)和

8、Ha-cup1。結(jié)果顯示,用1μM20E處理細胞不同時間段后,幾乎所有被檢測的基因的表達量都上調(diào)。蛻皮激素受體EcRB1的表達量在處理后的3-12 h內(nèi)最高,而USP1要在處理12 h后才有明顯表達。其它兩個轉(zhuǎn)錄因子E74a和E75b的表達在處理3 h后也明顯上調(diào)。HHR3經(jīng)20E處理后在3 h內(nèi)就開始轉(zhuǎn)錄表達并且在12小時后達到高峰,隨后逐漸下降。蛻皮激素相關(guān)蛋白ecdy和羧肽酶A2(carbA2)的表達量也上調(diào)。核轉(zhuǎn)移因子2(NTF

9、2)和G蛋白γ亞基(G-proy)也可以被20E誘導上調(diào)表達。當用20E先處理細胞12 h而后再撤掉激素繼續(xù)培養(yǎng)不同時間段后,EcRB1,USP1和HHR3的表達在撤掉激素6 h后就消失了,其它基因的表達量也相繼下降,而表皮蛋白1(cup1)在撤除激素后仍持續(xù)表達。這些結(jié)果說明20E調(diào)控這一組基因的表達,并且EcRB1,USP1和HHR3等上游轉(zhuǎn)錄因子的表達依賴于20E的存在。
　　 該部分研究得到如下結(jié)論:本實驗室前期建立的H

10、aEpi系確屬表皮組織來源的表皮細胞系；HaEpi系是一個可誘導和可干擾的細胞系；20E可以誘導HaEcRB1等一組基因的上調(diào)表達。綜上,該細胞系可以用來研究激素的調(diào)控效應(yīng),并且通過進行RNAi極大地方便了基因功能的研究。
　　 2.棉鈴蟲蛻皮激素受體HaEcRB1、超氣門蛋白HaUsP1和熱休克蛋白同源物Hsc70在20E信號途徑中的功能研究
　　 為了研究蛻皮激素信號轉(zhuǎn)導的分子機理,分別克隆得到了棉鈴蟲蛻皮激素受體H

11、aEcRB1,超氣門蛋白HaUSP1及熱休克蛋白同系物HaHsc70的全長序列。HaEcRB1全長1871bp,編碼545個氨基酸。HaUSP1全長2290bp,編碼414個氨基酸。HaHsc70全長2145bp,編碼654個氨基酸。DNAman多重序列比對結(jié)果表明,HaEcRB1,HaUSP1和HaHsc70分別與同源物種的相似性非常高。HaEcRB1與煙芽夜蛾Heliothis virescens(O18473)的相似性達96％;H

12、aUSP1與印度古螟P.interpunctella(AY619987)的相似性為91％；HaHsc70與煙草天蛾M.sexta(AY220911)的相似性高達98％。
　　 進一步用半定量RT-PCR研究了HaEcRB1、HaUSP1和HaHsc70在棉鈴蟲的組織分布和發(fā)育階段表達模式。結(jié)果顯示,HaEcRB1和HaUSP1的轉(zhuǎn)錄子在表皮、中腸、脂肪體和血細胞中都有表達,而在5齡蛻皮和6齡變態(tài)時期的表達量明顯高于5齡取食時期。

13、HaHsc70在四種組織中也都有表達,但它的轉(zhuǎn)錄本水平在各個時期是一致的。說明這三種基因在各種組織中廣泛表達,但HaEcRB1和HaUSP1在蛻皮和變態(tài)時存在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,而HaHsc70屬于組成性表達。體外20E誘導細胞和體內(nèi)注射20E的結(jié)果顯示,20E可以誘導HaHsc70上調(diào)表達,而保幼激素類似物methoprene未影響HaHsc70的表達水平。
　　 為了闡明這些基因在蛻皮激素信號轉(zhuǎn)導途徑中的功能,我們在表皮細胞系上將

14、HaEcRB1、HaUSP1和HaHsc70分別沉默,然后用RT-PCR檢測了HaEcRB1,HaUSP1,E74A,E75B,HHR3,ecdy,carbA2,NTF2,G-pro-γ,HaHsc70,Hsp90和印apoptosisinhibitor(apoi)等12個基因的表達情況。結(jié)果顯示,分別干擾HaUSP1、HaEcRB1和HaHsc70后,一系列基因的表達被抑制,包括轉(zhuǎn)錄因子E74A,E75B和HHR3,還有效應(yīng)基因ecd

15、y以及伴侶蛋白Hsc70,但NTF2、G-pro-γ、Hsp90和apoi的表達量未變化。有趣的是,在沉默HaHsc70后,HaEcRB1和HaUSP1表達明顯被抑制了,而分別干擾HaEcRB1、HaUSP1并不互相抑制對方的表達。這些結(jié)果說明HaEcRB1、HaUSP1和HaHsc70可能位于20E信號途徑的上游發(fā)揮作用。
　　 為了闡明HaHsc70參與蛻皮激素信號轉(zhuǎn)導的機理,進行了HaHsc70亞細胞定位研究。免疫細胞化學

16、結(jié)果顯示,在DMSO處理的對照組細胞中,HaHsc70定位于細胞質(zhì)中,當用20E處理細胞后,HaHsc70部分遷入核內(nèi)。然而,在methoprene處理細胞后,未觀察到HaHsc70的質(zhì)核遷移。相反,HaEcRB1和HaUSP1在未處理的細胞中主要位于細胞核中,用20E處理細胞后,HaEcRB1和HaUSP1在細胞核中的表達量明顯增加。然而,將HaHsc70干擾后,HaEcRB1和HaUSP1在細胞核中的信號明顯減弱。說明20E可使Ha