大鼠缺血—再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白組學及其心肌保護作用研究.pdf

1、缺血心肌恢復血流灌注過程中產(chǎn)生的心肌損傷,稱為心肌缺血一再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI),常見于冠心病等心血管疾病及外科心血管疾病治療過程。心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生涉及活性氧產(chǎn)生、鈣超載及能量代謝障礙等機制,其結(jié)果是導致心肌細胞的死亡。由過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基等活性氧導致的氧化應激在心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生過程中起著重要作用。
　　近年來,不少學者重視

2、細胞內(nèi)源性保護機制在疾病防治中的作用,關(guān)注焦點之一是熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)。HSPs是細胞在生理狀態(tài)下必需而在應激狀態(tài)(特別是熱應激)時表達增多的一類保護性蛋白質(zhì)。HSPs的主要功能是分子伴娘(molecular chaperone)功能,即參與蛋白質(zhì)的正確折疊、解聚、復性和協(xié)助轉(zhuǎn)運等。熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是HSPs家族中最為重要的成員。熱休克蛋

3、白70可分為組成型Hse70和誘導型Hsp72兩種,它們在結(jié)構(gòu)和功能方面類似。作為一個細胞中預先存在的分子伴侶,Hsc70具有顯著的抗心肌缺血及其他損傷作用。盡管已經(jīng)取得了上述進展,但心肌損傷時,Hsc70究竟與哪些分子相互作用從而發(fā)揮其心肌保護功能,目前仍不十分清楚。
　　為了篩選Hsc70相互作用的蛋白質(zhì),本研究采用ADP親和層析分離純化正常大鼠心肌和缺血.再灌注損傷心肌中的Hsc70相互作用蛋白,應用二維凝膠電泳(two-d

4、imensional gel electrophoresis,2-DE)技術(shù)進一步分離上述Hsc70相互作用蛋白質(zhì),采用圖像分析識別正常心肌組織和缺血-再灌注損傷心肌組織中Hsc70相互作用差異蛋白質(zhì)點,采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定差異蛋白質(zhì),然后采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)和體外蛋白質(zhì)重疊實驗(protein overlay assays)對相互作用關(guān)系進行驗證

5、。為了探討Hsc70抗心肌細胞損傷的具體機制,采用基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)檢測了Hsc70過表達和表達抑制對過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)所致的相互作用蛋白GAPDH、ENOA和ALDH2的表達和活性的影響;以及Hsc70過表達和表達抑制對過氧化氫所致的心肌細胞損傷的影響。主要的實驗結(jié)果如下:
　　1、大鼠缺血-再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白的初步篩選
　　(1)大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型

6、的構(gòu)建:結(jié)扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支30分鐘后再灌注60分鐘,血清中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)明顯增多。TTC染色顯示,與假手術(shù)組相比,缺血.再灌注損傷組心肌梗死面積明顯增加,提示心肌缺血.再灌注損傷模型構(gòu)建成功。
　　(2)大鼠缺血-再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白2-DE圖譜的建立與分析:采用ADP親和層析技術(shù)從正常心肌組織和缺血-再

7、灌注損傷心肌中分離純化Hsc70及其相互作用蛋白,應用2-DE技術(shù)建立了正常心肌和缺血.再灌注損傷心肌的Hsc70相互作用蛋白2-DE圖譜,圖像分析識別了56個差異的蛋白質(zhì)點,采用MALDI-TOF-MS鑒定了32個蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)32個蛋白質(zhì)中有21個為代謝相關(guān)蛋白,其功能主要涉及能量代謝、氧化磷酸化及電子傳遞等方面,說明Hsc70可能通過與這些蛋白質(zhì)的相互作用,在改善能量代謝、清除自由基等方面發(fā)揮心肌內(nèi)源性保護作用。
　　2、

8、大鼠缺血-再灌注損傷心肌中Hsc70相互作用蛋白的驗證
　　抽提正常和缺血.再灌注損傷大鼠心肌以及正常和暴露于H2O2的大鼠心肌細胞裂解液,應用Hsc70抗體進行免疫沉淀后,對沉淀物中的蛋白應用不同抗體進行Western blot分析。結(jié)果表明,在正常大鼠心肌和H9c2心肌細胞中,Hsc70與ENOA、GAPDH和ALDH2結(jié)合,氧化應激損傷時,Hsc70也可與ENOA、GAPDH和ALDH2結(jié)合,但是結(jié)合并沒有明顯差別。通過體外

9、蛋白質(zhì)重疊實驗,我們還發(fā)現(xiàn)Hsc70可與ENOA、GAPDH直接結(jié)合。
　　3、從分子伴侶角度研究Hsc70保護過氧化氫所致心肌細胞損傷的機制
　　(1)Hsc70對H2O2所致的ENOA、GAPDH和ALDH2表達的影響:
　　以真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)為載體構(gòu)建Hsc70的全長真核表達載體pcDNA3.1(-)-Hsc70,將Hsc70全長表達載體瞬時轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞,采用Western blot分析

10、證明細胞中的Hsc70表達明顯增加。將Hsc70RNA干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染心肌H9c2細胞,Western blot分析發(fā)現(xiàn)Hsc70在心肌細胞中表達明顯下調(diào)。
　　正常情況下,ENOA的表達在Hsc70過表達和Hsc70RNA干擾細胞中沒有明顯變化。H2O2處理后,心肌細胞中ENOA表達上調(diào),Hsc70過表達和Hsc70RNA干擾對H2O2所致的ENOA表達沒有明顯影響。
　　正常情況下,GAPDH和ALDH2的表達在Hsc7

11、0過表達和Hsc70低表達心肌細胞中沒有明顯改變。H2O2處理后,Hsc70過表達和Hsc70RNA干擾對GAPDH和ALDH2的表達也沒有影響。
　　以上結(jié)果說明在H2O2所致的大鼠心肌細胞氧化應激損傷中,Hsc70過表達和表達抑制均不影響ENOA、GAPDH和ALDH2的表達。
　　(2)Hsc70對H2O2所致的ENOA、GAPDH和ALDH2活性的影響:
　　收集正常和H2O2處理后的心肌細胞,檢測細胞中ENO

12、A、GAPDH的活性,發(fā)現(xiàn)正常情況下Hsc70過表達和低表達對大鼠心肌細胞中ENOA和GAPDH活性沒有明顯影響。經(jīng)H2O2處理后,大鼠心肌細胞中ENOA和GAPDH活性降低,但Hsc70過表達抑制了H2O2所致的ENOA和GAPDH活性下降,而Hsc70低表達促進了H2O2所致的ENOA和GAPDH活性下降。
　　采用50μmol/L的ALDH2的特異性抑制劑daidzin預處理心肌細胞后,收集正常和H2O2處理后的心肌細胞,檢

13、測細胞中ALDH2的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常情況下,Hsc70過表達或低表達對大鼠心肌細胞的ALDH2活性沒有明顯影響。Daidzin預處理后,細胞中ALDH2活性降低了50％。經(jīng)H2O2處理后,大鼠心肌細胞中ALDH2活性降低,而daidzin預處理再經(jīng)H2O2處理后ALDH2活性下降更為明顯。Hsc70過表達明顯抑制了H2O2所致的ALDH2活性降低,Hsc70低表達促進了H2O2所致的ALDH2活性下降。
　　(3)Hsc70對

14、H2O2所致大鼠心肌細胞損傷的影響:
　　Hsc70過表達對H2O2所致大鼠心肌細胞損傷的影響:應用Hsc70真核表達載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞,發(fā)現(xiàn)Hsc70過表達明顯抑制了H2O2所致的心肌細胞存活率降低、培基中LDH釋放和細胞凋亡發(fā)生。
　　Hsc70低表達對H2O2所致大鼠心肌細胞損傷的影響:應用RNA干擾技術(shù)抑制Hsc70的表達,發(fā)現(xiàn)Hsc70低表達進一步加劇了H2O2所致的心肌細胞存活率降低、培基中LDH釋放和細胞凋亡

15、發(fā)生。
　　Hsc70過表達和低表達對daidzin預處理后H2O2所致大鼠心肌細胞損傷的影響:daidzin預處理后再經(jīng)H2O2處理比單獨H2O2處理引起的心肌細胞壞死和細胞凋亡更為明顯,Hsc70過表達能夠減輕daidzin預處理后H2O2所致心肌細胞損傷,而Hsc70表達抑制加劇了daidzin預處理后H2O2所致心肌細胞損傷。
　　以上結(jié)果表明,在H2O2所致大鼠心肌細胞損傷中,Hsc70對H2O2所致的大鼠心肌細胞

16、損傷具有保護作用。
　　綜上所述,Hsc70是一個重要的內(nèi)源性保護蛋白,在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮重要保護作用。在缺血-再灌注損傷大鼠心肌及氧化應激的心肌細胞中,Hsc70與ENOA、GAPDH和ALDH2存在相互作用,并且Hsc70能夠直接與ENOA、GAPDH結(jié)合。在大鼠H9c2心肌細胞氧化應激損傷時,代謝相關(guān)的GAPDH、ENOA和ALDH2活性均降低,這些酶活性的降低可能增加了心肌細胞對氧化應激導致的心肌損傷的易感性。而