籽粒莧AmA1基因和人乳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)化水稻的研究.pdf

1、水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，稻米營養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)劣對人類健康和水稻生產(chǎn)具有重要的影響，其中蛋白質(zhì)、必需氨基酸和微量元素是人們主要關(guān)注的稻米營養(yǎng)特性。稻米蛋白質(zhì)中的賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和色氨酸等人體必需氨基酸含量偏低，以致其蛋白質(zhì)利用率低，營養(yǎng)不夠完全。所以，提高稻米蛋白質(zhì)中的必需氨基酸含量，顯得十分必要。AmAl是一種分離于籽粒莧(Amaranthus L.)種子的人體必需氨基酸平衡蛋白質(zhì)，該蛋白中

2、的8種人體必需氨基酸含量均超過FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)標準，且對人體不會造成過敏，在改良作物種子蛋白質(zhì)營養(yǎng)上具有重要的應(yīng)用前景。人乳鐵蛋白(human lactoferrin，hLF)具有多種生物學功能，不僅可以提高鐵營養(yǎng)，還具有廣譜抗病菌、調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)等功能，該生物學功能若能為水稻所利用，將大大增加稻米內(nèi)鐵的生物有效性。
　　 受到種質(zhì)資源及種間生殖隔離等因素的限制，利用常規(guī)育種手段改善稻米的營養(yǎng)品質(zhì)，存在一定困難。

3、本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將必需氨基酸平衡蛋白基因AmAl和人乳鐵蛋白基因hLF轉(zhuǎn)入水稻，使其在水稻種子中特異性高效表達，以達到改進稻米必需氨基酸組成和提高鐵營養(yǎng)的目的。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、為了使異源蛋白基因AmAl和hLF在轉(zhuǎn)基因水稻種子中特異性高效表達并積累。本研究首先根據(jù)已報道的水稻種子特異性啟動子核苷酸序列，從水稻中克隆了2個谷蛋白基因(GluB-1、Gt1)啟動子和1個油膜蛋白基因Ole18啟動子序列，并將這3個啟

4、動子以及組成型啟動子CaMV35S，分別與報告基因GUS相連再導(dǎo)入同一水稻品種中，以確定這些啟動子的表達強弱及特異性。序列分析和轉(zhuǎn)基因水稻的GUS活性分析結(jié)果表明：(1)從水稻“日本晴”克隆中的Gt1和ole18啟動子與已報道序列完全一致，從水稻“臺粳9號”中克隆的GluB-1啟動子序列與已報道序列存在部分堿基差異，二者同源性為97％。啟動子預(yù)測軟件NNPP、順式組件分析以及轉(zhuǎn)基因水稻實驗證實，該啟動子能引導(dǎo)GUS基因在水稻胚乳中特異性

5、表達，堿基差異沒有對其功能造成影響。(2)Gt1和GluB-1基因啟動子調(diào)控GUS基因在水稻胚乳中表達的活性強弱差異不大，但都明顯高于CaMV35S啟動子；Gt1啟動子和Ole18啟動子都具有嚴格的組織表達特異性，其中Gt1啟動子引導(dǎo)GUS基因僅在水稻胚乳中特異性表達，Ole18啟動子則能引導(dǎo)GUS基因僅在水稻胚和種皮中表達。
　　 2、根據(jù)已知的籽粒莧AmAl因序列，從籽粒莧“千穗谷NO1”種子中克隆了AmAl因的開放閱讀框序

6、列。序列分析表明，所克隆的AmAl因的開放閱讀框序列與已報道序列基本一致，僅存在1個堿基差異，但未改變氨基酸的編碼。應(yīng)用分子伴侶載體pBB540、pBB542和原核表達載體pET28a(+)進行了AmAl因的原核表達及融合蛋白純化。結(jié)果表明，經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)，AmAl因在宿主大腸桿菌中能正確表達出與預(yù)期大小一致(37kD)的融合蛋白，借助分子伴侶載體可以顯著提高AmAl融合蛋白的可溶性。
　　 3、對已報道的植物基因組DNA快

7、速提取方法作了進一步簡化和改進，建立了一種適于大規(guī)模轉(zhuǎn)基因水稻PCR檢測的微量DNA提取法。通過DNA提取質(zhì)量和PCR擴增效果比較發(fā)現(xiàn)，用該方法提取的水稻基因組DNA完整性較好，PCR擴增效果優(yōu)于堿裂解法，與試劑盒提取法無明顯的差異，結(jié)果穩(wěn)定可靠；而且整個提取過程操作簡單，花費時間少，平均一個樣品只需5-6min；起始植物材料用量少，僅需5～10mg。
　　 4、構(gòu)建了Gt1和Ole18基因啟動子分別驅(qū)動AmAl因表達的雙T-D

8、NA、雙MARs植物表達載體PCDMAR-pGt1-AmAlhpt和PCDMAR-pOle18-AmAlhpt，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將它們轉(zhuǎn)入水稻明恢86和臺粳9號中。PCR和Southern blot檢測表明，以上兩種載體攜帶的AmAl因均已整合到水稻基因組中。Westhern blot檢測結(jié)果顯示，Gt1和Ole18啟動子都能引導(dǎo)AmAl因在水稻種子中表達。T1代轉(zhuǎn)基因稻米的氨基酸含量檢測結(jié)果表明：(1)在Gt1啟動子調(diào)控AmAl因

9、表達的轉(zhuǎn)基因水稻中，有9個株系種子中的7種必需氨基酸含量(占種子總干重)比對照有不同程度地提高，最大提高幅度為44.44％；有2個株系種子總氨基酸中的三種限制性必需氨基酸含量(即占總氨基酸的百分比)均比對照顯著提高，其中賴氨酸最大提高了5.58％，蘇氨酸最大提高了3.12％，甲硫氨酸最大提高了5.58％。(2)在Ole18啟動子調(diào)控AmAl基因表達的轉(zhuǎn)基因水稻中，有5個轉(zhuǎn)基因株系種子中的7種必需氨基酸含量比對照有不同程度提高，最大提高幅

10、度為15.56％，但只有1個株系的賴氨酸占總氨基酸的百分比對照提高了4.4％，其它株系種子總氨基酸中的必需氨基酸含量沒有明顯變化。以上結(jié)果說明，在Gt1啟動子的調(diào)控下，AmAl因能在水稻胚乳中特異性表達，且對提高水稻種子總氨基酸中的3種限制性必需氨基酸含量，具有一定的效果。
　　 5、在不改變氨基酸序列的前提下，根據(jù)水稻密碼子的偏好性對人乳鐵蛋白基因hLF和籽粒莧AmAl基因序列進行了優(yōu)化設(shè)計，調(diào)整并去除了會影響基因轉(zhuǎn)錄、翻譯效

11、率及mRNA穩(wěn)定性的序列元件，同時對這兩個基因的5’端和3’端進行了適當修飾：(1)hLF基因經(jīng)優(yōu)化后，編碼區(qū)核苷酸序列與原來一致性為76.3％，692個密碼子中有431個被改變，總的G+C含量和密碼子第三位G+C含量分別由原來的53.82％、59.88％提高到56.28％、66.38％；原基因中存在的3個PPSS序列和3處AT富集區(qū)全部被去除。并將其5’端的信號肽替換成谷蛋白基因GluB-1的信號肽序列，在3'端添加了一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信

12、號KDEL序列和兩個終止密碼子TGATAA。(2)AmAl基因優(yōu)化后、編碼區(qū)核苷酸序列與原來保持了76.0％的一致性，305個密碼子中有192個被改變，總的G+C含量和第三位G+C含量分別從原來的34.43％、29.51％提高到49.95％、71.48％；原基因中存在的17個PPSS序列、3處ATTTA序列和2處AT富集區(qū)分別減少到優(yōu)化后的5、0和1；并在5’端添加了谷蛋白基因Gt1的信號肽序列。
　　 6、人工合成了優(yōu)化后的h

13、LF、AmAl基因(命名為omhLF、omAmAl)。為了比較hLF、AmAl基因優(yōu)化前后在水稻中的表達水平差異，分別將優(yōu)化前后的hLF、AmAl基因轉(zhuǎn)入水稻臺粳9號中，共獲得PCR陽性植株178株。同時構(gòu)建了含有omhLF、omAmAl雙基因的雙T-DNA植物表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻蜀恢527中，經(jīng)PCR檢測，有34株水稻轉(zhuǎn)化植株能擴增出與預(yù)期大小一致的omhLF、omAmAl基因片段。由于上述轉(zhuǎn)基因水稻植株目前正處在T0