乳鐵蛋白的仿生親和純化研究.pdf

1、人乳鐵蛋白是一種分子質(zhì)量為70～80 kD的糖蛋白，屬轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員，具有廣譜抗菌，抗病毒，抗腫瘤，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等多種生物活性，在功能營(yíng)養(yǎng)食品和醫(yī)療保健等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。過(guò)去，因人乳鐵蛋白來(lái)源有限，嚴(yán)重限制了其商業(yè)開(kāi)發(fā)。隨著動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了牛乳腺生物反應(yīng)器，在牛乳腺中高量表達(dá)重組人乳鐵蛋白，牛乳中人乳鐵蛋白濃度達(dá)2.529±0.212 mg/mL～3.429±0.417 mg/mL，

2、有可能實(shí)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白在牛乳腺中的規(guī)模生產(chǎn)。本課題研究目的是針對(duì)乳鐵蛋白研究開(kāi)發(fā)仿生親和配體，仿生親和分離材料以及建立從轉(zhuǎn)基因牛乳中大規(guī)模純化重組人乳鐵蛋白的工藝。 本研究首先設(shè)計(jì)合成了一個(gè)仿生親和分離材料庫(kù)，含322中不同結(jié)構(gòu)的配體；利用篩選方法得到了特異性結(jié)合重組人乳鐵蛋白的β-丙氨酸親和配體，其結(jié)構(gòu)為β-丙氨酸經(jīng)三氯三嗪間隔臂共價(jià)偶聯(lián)于氨基活化的Sepharose-6B上。通過(guò)對(duì)固定化β-丙氨酸純化重組人乳鐵蛋白的pH

3、和離子強(qiáng)度條件進(jìn)行優(yōu)化，確定介質(zhì)對(duì)重組人乳鐵蛋白的最佳結(jié)合條件為：50 mM Tris-HCl/0.1 M NaCl，pH 7.0；最佳洗脫條件為：0.1 M Gly-HCl，pH 2.4。純化得到的重組人乳鐵蛋白純度>95％，回收率達(dá)81.6％，固定化β-丙氨酸對(duì)重組人乳鐵蛋白的最大吸附量達(dá)65.6mg/g 干介質(zhì)，并且能夠耐受NaOH溶液的清洗與再生。 經(jīng)MALDI-TOF鑒定，所純化的蛋白即為重組人乳鐵蛋白。N端測(cè)序結(jié)果

4、表明，重組人乳鐵蛋白N端氨基酸序列為GRRRRSVQW，與天然人乳鐵蛋白相同。 對(duì)重組人乳鐵蛋白最重要的兩個(gè)生物學(xué)活性進(jìn)行了鑒定。在體外經(jīng)鐵溶液處理后，重組與天然人乳鐵蛋白均能結(jié)合鐵離子，而且這種鐵結(jié)合能力與環(huán)境中的pH直接相關(guān)。當(dāng)pH降至4.5時(shí)，鐵離子開(kāi)始從蛋白中釋放出來(lái)。在pH 2.0時(shí)，蛋白幾乎全部釋放掉自身結(jié)合的鐵離子。這表明重組人乳鐵蛋白具有與天然人乳鐵蛋白類(lèi)似的鐵結(jié)合與釋放能力。重組人乳鐵蛋白具有抑菌活性，當(dāng)大腸