我國部分地區(qū)雞源H9N2亞型AIV的系統(tǒng)進(jìn)化和HA抗原分析以及AIV NA分型方法的研究.pdf

1、禽流感(Avian Influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的多種動(dòng)物易感的傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一。人類歷史上多次發(fā)生流感的流行毒株均與禽源流感病毒有關(guān)系。二十世紀(jì)末相繼發(fā)生了H5,H7和H9亞型的AIV由禽類直接傳染給人類的事件。因此對(duì)AIV在不同種類的宿主中的流行情況進(jìn)行持續(xù)的追蹤和監(jiān)測，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
　　 本文對(duì)我國部分養(yǎng)禽密集地區(qū)的

2、H9N2亞型AIV流行株進(jìn)行了分子流行病學(xué)監(jiān)測和血凝素(Hemaglutinin,HA)抗原性分析，明確了這些毒株的進(jìn)化特點(diǎn)。并針對(duì)目前因缺乏AIV的神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)快速分型方法而導(dǎo)致的AIV監(jiān)測中病毒NA分型困難的實(shí)際問題，建立了用于區(qū)分AⅣ9個(gè)NA亞型的熒光定量RT-PCR方法。主要研究內(nèi)容如下：1.我國部分地區(qū)雞源H9N2亞型禽流感病毒的系統(tǒng)進(jìn)化和抗原性分析H9N2是目前國內(nèi)雞群中流行最為廣泛的禽流感

3、病毒亞型，給我國的養(yǎng)雞業(yè)造成了重要危害。相比于高致病性的H5N1亞型AIV,H9N2病毒因其致病力較低而易于在雞群中持續(xù)感染和更廣泛的傳播，從而在流感病毒的基因重組中發(fā)揮著重要作用。1997年，香港禽流感感染人事件之后，我國加強(qiáng)了AIV的流行病學(xué)調(diào)查研究。但對(duì)近年來H9N2流感病毒在雞群中的系統(tǒng)進(jìn)化情況，尚缺乏系統(tǒng)和全面的研究資料。本研究中，我們對(duì)1998-2008年間分離自山東，河南，河北，天津和江蘇北部的發(fā)病雞群中的17株H9N2亞

4、型禽流感病毒進(jìn)行了全基因組的序列測定和血凝素抗原的分析，揭示了該地區(qū)雞源H9N2病毒的系統(tǒng)進(jìn)化特征。
　　 分別研究了17株AIVH9N2分離株各基因片段的基因類型(genetype)以及病毒的基因型（genotype）。對(duì)17株H9N2病毒的8個(gè)基因片段(PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M和NS)分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，各分離毒株的HA基因片段均隸屬于H9基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的A/chicken/Beijing/1/94分

5、支(BJ94分支);NS基因片段均隸屬于NS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的A等位基因群的BJ94分支；M基因隸屬于該基因進(jìn)化樹的BJ94分支或A/quail/HongKong/G1/97分支（G1分支）：NA基因隸屬于N2基因進(jìn)化樹的BJ94分支或A/chicken/HongKong/G9/97分支（G9分支）；PB2,PB1和NP基因隸屬于相應(yīng)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的BJ94分支或A/chicken/Shanghai/F/98分支(F98分支);PA基因隸

6、屬于該基因進(jìn)化樹的BJ94分支，或者F98分支，或者A/duck/HongKong/Y439/97分支（Y439分支）。對(duì)AIV各分離毒株的基因型（Genotype）分析表明，這17株病毒共劃分為7種不同的基因型：A,H,M,N,O,P和Q。其中M-Q共5個(gè)基因型是首次報(bào)道的H9N2流感病毒基因型。以基因型A和H的H9N2病毒為進(jìn)化母本，這些新基因型的H9N2分離株經(jīng)歷了一重到四重的基因重組。通過雞源H9N2毒株基因型的比較分析，我們發(fā)

7、現(xiàn)本研究中新基因型的H9N2病毒分離株，并非來源于華南地區(qū)已報(bào)道的H9N2流行株向北方地區(qū)的傳播，而很可能來自不同流感病毒毒株的基因重組。
　　 對(duì)17個(gè)H9N2分離毒株的推導(dǎo)氨基酸序列的分子特征分析表明，有15個(gè)分離毒株的血凝素(HA)存在7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，而另外兩個(gè)毒株(CKSDB198和CKBJL105)潛在糖基化位點(diǎn)的數(shù)目為6個(gè)（298-300AA糖基化位點(diǎn)喪失）；17株H9N2分離毒株的NA基因，其中4個(gè)隸屬于G9

8、分支者(CKZBB108,CKHNL108,CKHNL208和CKHNL308)編碼469AA的NA蛋白。而其余13個(gè)隸屬于BJ94分支者，則編碼466AA的NA蛋白（其莖部的62-64位氨基酸缺失）；有2株病毒(CKSDB407和CKZBB108)的M2蛋白存在S31N的變異，而其余15株分離毒的M2蛋白不存在該位點(diǎn)的變異。這一變異是具有金剛烷胺抗藥性的流感病毒的分子特征。
　　 血凝素是禽流感病毒誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主

9、要蛋白抗原，也是病毒毒力和宿主特異性的主要決定因素。上述分子流行病學(xué)的研究表明，本文中的H9N2分離毒株，其HA基因同源性很高(90.2％-100％)，在系統(tǒng)進(jìn)化上均屬于H9基因的BJ94分支。選取分離自2002-2008年間的12個(gè)H9N2亞型病毒株（分別屬于A,H,N,O和Q基因型）分別制備滅活疫苗，接種SPF雞，于隔離飼養(yǎng)器中飼養(yǎng)，制備陽性血清。然后以這12株H9N2病毒作抗原，與各毒株的陽性血清進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)(hemagg

10、lutination-inhibitiontest,HI)。結(jié)果表明：各分離株的血清能夠抑制所有12株AIV的血凝活性，雖然其抑制價(jià)存在差異。進(jìn)一步的R值分析表明，交叉HI效價(jià)差異不顯著，即：這12株H9N2分離株的HA的血凝活性沒有顯著差異。該結(jié)果表明這些H9N2分離毒株HA基因的點(diǎn)突變并未造成血凝素抗原的明顯變異。
　　 此外，本研究的17個(gè)分離毒株的PB1-F2基因編碼6種不同長度的蛋白。該基因所編碼蛋白長度的多態(tài)性促使我

11、們進(jìn)一步調(diào)查了國內(nèi)不同亞型和宿主來源的A型流感病毒(InfluenzaAvirus,IAV)中PB1-F2基因的流行情況。本研究從Genbank數(shù)據(jù)庫下載了禽源、豬源和人源H5N1和H9N2亞型AIV、人源和豬源H1N1和H3N2流感病毒的PB1-F2基因共計(jì)337個(gè)，系統(tǒng)的對(duì)其進(jìn)行了分子進(jìn)化分析。結(jié)果表明流感病毒PB1-F2基因的進(jìn)化與其HA基因的進(jìn)化相關(guān)聯(lián)：H1和H3亞型病毒的PB1-F2基因在系統(tǒng)進(jìn)化上具有獨(dú)立的分支，明顯區(qū)別與H

12、5和H9亞型的AIV的PB1-F2基因的進(jìn)化；IAV因宿主來源的不同，編碼功能性的PB1-F2蛋白的比率也存在差異。對(duì)PB1-F2流行特征的分析有利于對(duì)該蛋白功能及作用機(jī)理的深入研究。
　　 2.禽流感病毒NA亞型分型的熒光定量RT-PCR方法研究禽流感病毒的分子生物學(xué)檢測方法為其流行病學(xué)監(jiān)測提供了敏感而快速的技術(shù)手段。目前已發(fā)展了多種針對(duì)AIV的型特異性抗原(M或NP)基因以及常見的HA和NA亞型鑒定的分子檢測方法，但是對(duì)全部

13、9種NA亞型進(jìn)行分型鑒定的分子生物學(xué)方法則鮮見報(bào)道。本研究應(yīng)用PrimerHunter軟件分別設(shè)計(jì)了針對(duì)9種NA亞型的AIV引物，使用SYBRGreenI為檢測染料，以體外轉(zhuǎn)錄的N1-N9亞型的RNA標(biāo)準(zhǔn)品為檢測模板，建立了用于NA分型的熒光定量RT-PCR(realtimeRT-PCR,RRT-PCR)方法。在上述基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了引物池(primerpool)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行4個(gè)反應(yīng)即可鑒別AIV的9種不同的NA亞型。所建立的RRT-PCR方