AIV鑒定、擴(kuò)增及測(cè)序引物的優(yōu)化和應(yīng)用及H9N2亞型AIV對(duì)哺乳動(dòng)物潛在危害的分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、亞型鑒定是禽流感病毒研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)而重要的工作。由于禽流感病毒的不斷進(jìn)化，給禽流感病毒的診斷工作帶來(lái)了新的問(wèn)題。目前常用的亞型鑒定方法是RT-PCR反應(yīng)，而引物決定RT-PCR反應(yīng)的特異性和靈敏性。為適應(yīng)禽流感病毒的變異，RT-PCR反應(yīng)中使用的引物需要不斷的更新。
　　因H5、H7、H9、H3、H4和H6，N1、N2、N6、N8及N9為目前流感病毒的優(yōu)勢(shì)亞型，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有的及GeneBank中的序列，進(jìn)行比對(duì)，使用Prime

2、r5軟件設(shè)計(jì)這些亞型的HA和NA的通用擴(kuò)增引物及特異性的鑒定引物。禽流感病毒的內(nèi)部基因相對(duì)比較保守，下載各亞型禽流感病毒的六個(gè)內(nèi)部基因序列，比對(duì)后，設(shè)計(jì)通用引物。在測(cè)序方面，采用一對(duì)M13F/M13R引物替代之前的分節(jié)段測(cè)序引物。
　　采用優(yōu)化的引物對(duì)2013-2015年邊境省份的禽流感流行病學(xué)調(diào)查中分離到的41株禽流感病毒進(jìn)行了亞型鑒定和序列測(cè)定。包括5株H5N6亞型、2株H5N1亞型、10株H3N2亞型及24株H9N2亞型。對(duì)

3、41株病毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)：5株H5N6亞型禽流感病毒集中于clade2.3.4.4分支；2株H5N1亞型禽流感病毒屬于clade2.3.2.1c分支；10株H3N2亞型禽流感病毒均處于歐亞禽源病毒分支；24株H9N2亞型禽流感病毒都分布在BJ/1/94亞群。關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：所有H5亞型病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)均有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，符合HPAIV的特征；所有H3和H9亞型病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)均不含有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸

4、，符合LPAIV的特征。同源性分析發(fā)現(xiàn)：2株從虎體內(nèi)分離到的H5N1亞型禽流感病毒為重組病毒，其內(nèi)部基因由H9N2亞型禽流感病毒提供。
　　H9N2禽流感病毒為感染人的流感病毒，如1997年的香港H5N1禽流感病毒、2013年的H7N9及H10N8禽流感病毒，這些新型重組病毒提供了內(nèi)部基因片段，并在新型禽流感病毒的產(chǎn)生中起重要作用。H9N2亞型禽流感病毒在我國(guó)流行甚廣，本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離到了多株H9N2亞型禽流感病毒

5、。為探究H9N2亞型禽流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病機(jī)制，選取Civet/GX/S9/13（H9N2）病毒株在小鼠上進(jìn)行了致病性和適應(yīng)性研究。原代Civet/GX/S9/13（H9N2）僅在BALB/C鼠的肺臟和鼻甲骨中呈較低程度的復(fù)制，對(duì)小鼠不致死，呈低致病性。將該病毒在BALB/C鼠體內(nèi)繼代感染，其在小鼠的肺臟和鼻甲骨中復(fù)制滴度增高，第8代病毒致死BALB/C鼠，對(duì)BALB/C鼠的致病性增強(qiáng)。分析繼代感染病毒的氨基酸位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)只有PB2蛋