古典H1N1亞型豬流感病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)毒力增強(qiáng)的分子機(jī)制研究.pdf

1、基因突變或重組引發(fā)的病毒毒力與宿主適應(yīng)性的改變是流感病毒早期演化的驅(qū)動(dòng)因素。古典H1N1亞型豬流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)自首次分離以來(lái)一直存在于世界各地，多次跨越種間屏障感染人，甚至造成了致人死亡的嚴(yán)重后果。古典H1N1亞型SIV在我國(guó)豬群中屬于優(yōu)勢(shì)毒株，一旦跨越種間屏障適應(yīng)新宿主，就極有可能在人群中引發(fā)新一輪的流感大流行。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)古典H1N1亞型SIV跨宿主感染哺乳動(dòng)物的宿主適應(yīng)與致病機(jī)制還不清

2、楚。
　　本研究以BALB/c小鼠為哺乳動(dòng)物模型，模擬了古典H1N1亞型SIV跨越種間屏障適應(yīng)哺乳動(dòng)物新宿主的過(guò)程，將一株低致病性的古典H1N1亞型SIV野生株(G11-WT)在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳13代，得到了病毒毒力明顯增強(qiáng)的鼠適應(yīng)株(G11-MA)，G11-MA(MLD50=3.31og10TCID50)的毒力比G11-WT(MLD50＞6.5log10TCID50)至少增加了103倍。
　　為探究古典H1N1亞型SIV適應(yīng)

3、哺乳動(dòng)物新宿主后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的不同影響，本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)不同病毒感染小鼠后的肺組織進(jìn)行了mRNA轉(zhuǎn)錄組差異性分析。結(jié)果表明，本次測(cè)序共檢測(cè)到47719個(gè)基因，按照基因差異表達(dá)顯著性篩選標(biāo)準(zhǔn):FDR＜0.05且|log2FC|＞=1，共篩選到7118個(gè)差異顯著表達(dá)基因。與對(duì)照組相比，G11-WT只有1178個(gè)差異基因，而G11-MA有4033個(gè)差異基因。與G11-WT相比，G11-MA有1907個(gè)差異基因，包括706個(gè)上調(diào)，1

4、201個(gè)下調(diào)。通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行GO分類(lèi)統(tǒng)計(jì)與KEGG分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)比對(duì)組中有大量的差異基因參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子及其受體互作相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程及通路。與G11-WT相比，G11-MA感染小鼠后引起宿主更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，導(dǎo)致宿主體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)失衡，出現(xiàn)炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，引發(fā)了細(xì)胞因子風(fēng)暴和宿主免疫調(diào)節(jié)機(jī)能紊亂，這可能就是G11-MA對(duì)小鼠致病性更強(qiáng)的機(jī)制之一。
　　為進(jìn)一步探究古典H1N1亞型SIV跨宿主感染哺乳動(dòng)物的宿

5、主適應(yīng)與致病機(jī)制，本研究對(duì)G11-WT、G11-MA進(jìn)行了序列測(cè)定和氨基酸差異性分析，結(jié)果表明，與G11-WT相比，G11-MA存在4個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，即PB2(D740N)、PB1(T56I)、PA(T97I)、HA(K188E)。為確定關(guān)鍵的毒力相關(guān)因子及分子致病基礎(chǔ)，我們運(yùn)用反向遺傳操作技術(shù)，以G11-WT與G11-MA為骨架，通過(guò)單基因或雙基因片段的替換，拯救并鑒定了多種病毒。體內(nèi)外研究結(jié)果表明，PB2(D740N)、PA(T