豬源2009甲型H1N1大流行流感病毒及其H9N2重組病毒在哺乳動(dòng)物模型的致病性和傳播特性.pdf

1、PathogenicityandTransmissibilityofSwineOrigin2009PandemicHINlInfluenzaVirusesandTheirReassortantH9N2InfluenzaVirusesinMammalianModelsADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilos

2、ophylnPreventiveVeterinaryMedicineCollegeofVeterinaryMedicineYangzhouUniversityYangzhou，PRChinaPhDcandidate：LiangHeAdvisor：ProfXiufanLiuMay2014II揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文CA04這對(duì)模式病毒成功建立了評(píng)價(jià)強(qiáng)弱毒力的2009甲型H1N1病毒的小鼠動(dòng)物模型。流感病毒獲得結(jié)合a2，6唾液酸受體的能力是其在

3、哺乳動(dòng)物間有效傳播的先決條件。為進(jìn)一步研究5株2009甲型H1N1病毒在哺乳動(dòng)物模型的傳播能力，我們首先對(duì)其進(jìn)行了受體結(jié)合能力的測(cè)定。結(jié)果表明，人源2009甲型H1N1參考株CA04顯示出完全的a2，6唾液酸受體(人源受體)結(jié)合能力，而其余4株豬源的2009甲型H1N1病毒均獲得了不同程度的結(jié)合a2，3唾液酸受體(禽源受體)的能力。其中，A／Swine／Jiangsu／46／2010(JS46)和A／Swine／Jiangsu／48／2

4、010(JS48)兩株流感病毒顯著偏嗜于結(jié)合旺2，3唾液酸受體。與在豚鼠動(dòng)物模型上的直接接觸傳播能力測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)，JS46和JS48分別表現(xiàn)出一過(guò)性的和無(wú)法檢測(cè)到的直接接觸傳播能力，而其余的病毒的直接接觸傳播效率為100％。因此，我們假設(shè)是JS46和JS48的受體結(jié)合能力的改變導(dǎo)致這種直接接觸傳播能力的下降。通過(guò)生物信息學(xué)的方法比較了JS48和CA04的HA蛋白序列和結(jié)構(gòu)的差異，初步確定HA的N159D和Q226R雙突變的聯(lián)合作用改變

5、了病毒的受體結(jié)合能力。為證明N159D和Q226R聯(lián)合突變對(duì)直接接觸傳播能力的影響，通過(guò)反向遺傳技術(shù)拯救了CA04原毒rCA04，單突變病毒rCA04159和rCA04226，以及雙突變病毒rCA04159／226，并在此在豚鼠模型進(jìn)行了直接接觸傳播能力的檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有雙突變病毒rCA04159／226的直接接觸組豚鼠鼻洗液無(wú)法檢測(cè)到病毒，其余3株拯救毒均可以發(fā)生100％的傳播效率。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)表明，雙突變后的rCA04159／2

6、26在攻毒組豚鼠鼻腔的復(fù)制能力顯著降低。單突變Q226R可以通過(guò)減慢病毒傳播速率的方式影響直接接觸傳播。然而，盡管rCA04159／226雙突變病毒接觸組豚鼠無(wú)法檢測(cè)到排毒，血清抗體檢測(cè)卻顯示出60％的豚鼠發(fā)生了血清陽(yáng)性轉(zhuǎn)換，表明N159D和Q226R雙突變具有聯(lián)合作用可以極顯著的降低直接接觸傳播能力，但并沒(méi)有使傳播完全消失。我們?cè)趯?duì)江蘇地區(qū)的豬流感流行病學(xué)監(jiān)測(cè)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前流行于我國(guó)的h9425的H9N2禽流感病毒也感染豬群，這就為H

7、9N2禽流感病毒與2009甲型H1N1大流行流感病毒的重組提供了可能。為了預(yù)測(cè)這種重組的潛在大流行風(fēng)險(xiǎn)，我們通過(guò)反向遺傳技術(shù)，以CA04、JS48和A／Swine／Jiangsu／285／2010(JS285)三株不同宿主源的2009甲型H1N1的內(nèi)部基因?yàn)楣羌?，將一株豬源的H9N2禽流感病毒A／Swine／Taizhou／5／08(TZ5)的HA單替換或?qū)A和NA雙替換其中分別拯救了H9N1pHlNl和H9N2pHlNl重組病毒。重