含有pdmH1N1-09內(nèi)部基因的H9N2重組病毒在豚鼠間傳播特性和小鼠致病性的研究.pdf

1、氣溶膠傳播途徑作為流感病毒高效的傳播途徑已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。2009年大流行H1N1流感病毒(pdmH1N1/09)能夠通過(guò)氣溶膠傳播途徑在雪貂和豚鼠進(jìn)行有效的傳播并且能夠引起人類的死亡。通過(guò)反向遺傳技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)pdmH1N1/09的基因片段與其他亞型的禽流感病毒(Avian influenza viruses，AIVs)和季節(jié)性流感病毒的基因片段具有很好的適配性。已有的研究也表明含有pdmH1N1/09 PA和NS基因的高致病性H

2、5N1禽流感病毒(H5 HPAIV)能獲得在雪貂間的氣溶膠傳播能力。
　　在我國(guó)H9N2亞型AIVs從20世紀(jì)90年代末開始流行，并偶爾發(fā)生感染哺乳動(dòng)物的病例。流行病學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)H9N2亞型AIVs血凝素蛋白(HA)的第226位氨基酸為L(zhǎng)的毒株數(shù)量越來(lái)越含優(yōu)勢(shì)，受體結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)也表明H9N2亞型AIVs能結(jié)合哺乳動(dòng)物的受體。此外，PB2片段上627位氨基酸的“人源化”，也為H9N2亞型AIVs在哺乳動(dòng)物間進(jìn)行高效的氣溶膠傳播提供

3、了必要的條件。更為重要的是，已有的研究表明自然界分離的H9N2毒株已獲得在雪貂間的氣溶膠傳播能力。
　　H9N2亞型AIVs和pdmH1N1/09病毒可同時(shí)在同一地區(qū)甚至同一動(dòng)物中分離到，例如豬、犬和貓中，這樣大大增加了它們進(jìn)行重組的可能。此外，目前新出現(xiàn)的H7N7、H7N9、H10N8以及H5N2等一些病毒的內(nèi)部基因均來(lái)源于H9N2亞型AIVs。因此，研究H9N2 AIVs和pdmH1N1/09重組的可能性以及重組病毒的傳播特性

4、和致病特性對(duì)于流感大流行的預(yù)警有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果證明了攜帶H9N2亞型AIVs的兩個(gè)外部基因以及pdmH1N1/09六個(gè)內(nèi)部基因的重組H9N2亞型AIVs能獲得在豚鼠間的氣溶膠傳播能力。然而，我們尚不清楚pdmH1N1/09的哪個(gè)或者哪些內(nèi)部基因影響重組H9N2流感病毒的氣溶膠傳播能力。在本研究中，我們拯救了一系列的重組H9N2流感病毒，并對(duì)其傳播性能和致病性進(jìn)行了探索。我們發(fā)現(xiàn)NP、M和NS這三個(gè)片段的共同

5、作用能使重組的H9N2病毒獲得在豚鼠間的高效氣溶膠傳播能力，并且同時(shí)也能增強(qiáng)重組病毒對(duì)小鼠的毒力。
　　1、H9N2重組病毒的拯救及其在豚鼠間傳播能力的測(cè)定
　　我們首先對(duì)2007年至2013年華東地區(qū)的H9N2亞型AIVs的八個(gè)基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前H9N2 AIVs的優(yōu)勢(shì)基因型為S基因型。同時(shí)將已經(jīng)發(fā)表的與pdmH1N1/09重組的H9N2流感病毒與本室的分離株進(jìn)行了序列比對(duì)分析，并繪制進(jìn)化樹。我們發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)

6、的H9N2地方流行株與已發(fā)表選用的H9N2亞型AIVs存在較大差異。因此，我們選擇實(shí)驗(yàn)室分離的華東地區(qū)優(yōu)勢(shì)流行株A/Chicken/Jiangsu/Wujin/57/2012(WJ57)和pdmH1N1/09的代表株A/Ca1ifornia/04/2009(CA/04)作為構(gòu)建系列重組病毒的母本病毒。
　　首先，我們拯救了含有WJ57 HA和NA基因以及CA/04的內(nèi)部基因的H9N2重組病毒[W(HA+NA)-C]，并測(cè)定了該重組

7、病毒及其母本病毒W(wǎng)J57和CA/04的傳播性能。結(jié)果顯示W(wǎng)(HA+NA)-C重組病毒獲得了在豚鼠間的高效氣溶膠傳播能力。然后，我們以W(HA+NA)-C為骨架，將WJ57的內(nèi)部基因逐個(gè)替換上去，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將NP、M和NS這三個(gè)基因單獨(dú)替換到H9N2重組病毒W(wǎng)(HA+NA)-C時(shí)[即:W(NP+HA+NA)-C、W(M+HA+NA)-C、W(NS+HA+NA)-C]，這些重組病毒喪失了在豚鼠間的氣溶膠傳播能力。這些結(jié)果表明CA/04的NP、N

8、S和M基因?qū)τ谥亟M病毒在豚鼠間的氣溶膠傳播能力非常關(guān)鍵。因此，接下來(lái)我們分別將CA/04的M、M+NS、NP+M+NS替換至WJ57骨架上，并測(cè)定了重組病毒的傳播性能。結(jié)果顯示，只有當(dāng)CA/04的三個(gè)內(nèi)部片段NP、M和NS同時(shí)替換到WJ57上時(shí)，重組的H9N2病毒C(NP+M+NS)-W才具有氣溶膠傳播能力。并且C(NP+M+NS)-W和W(HA+NA)-C氣溶膠傳播組的豚鼠呈現(xiàn)出高滴度的排毒。
　　2、H9N2重組病毒在小鼠中的

9、致病能力測(cè)定
　　基于以上研究結(jié)果，我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)了CA/04、WJ57、W(HA+NA)-C、W(HA+NA+NP)-C、W(HA+NA+M)-C、W(HA+NA+NS)-C和C(M+NS+NP)-W重組病毒在體內(nèi)外的復(fù)制能力以及對(duì)小鼠的致病力。結(jié)果顯示，C(M+NS+NP)-W重組病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的復(fù)制能力以及對(duì)小鼠的致病性都要強(qiáng)于其母本病毒W(wǎng)J57。而W(HA+NA+NP)-C、W(HA+NA+M)-C和W(HA+NA+