H9N2亞型AIV HA2基因在重組桿狀病毒和畢赤酵母菌中的表達(dá).pdf

1、禽流感(AivanInfluenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的傳染性疾病綜合癥。低致病力禽流感常引起呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋量下降。1994年首次報(bào)道H9N2亞型AIV在中國流行，并且已成為中國現(xiàn)有AIV的主要亞型。近幾年發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV不僅感染禽類，還感染豬和人。因此，開展對(duì)禽流感病毒H9N2亞型的研究，加強(qiáng)對(duì)H9N2亞型AIV的監(jiān)控，不僅在病毒學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等學(xué)科上有重要的學(xué)術(shù)意義，而其公共衛(wèi)生等方面也具有重大的社會(huì)意義。

2、 本試驗(yàn)根據(jù)GenBank所發(fā)表的HA基因的cDNA序列，利用Primer5.0軟件，參照昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以本實(shí)驗(yàn)室所保存的pMD18-T-HA2陽性質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出HA2基因，命名為BHA2。將其克隆至昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis2A的BamHI和SalⅠ之間的多克隆位點(diǎn)上，命名為pBlueBacHis2A-BHA2。純化該重組質(zhì)粒并與桿狀病毒共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，5d后獲得重組

3、病毒，名為P1。將經(jīng)過3輪噬斑篩選純化P1接種Sf9細(xì)胞大量繁殖后收獲，PCR鑒定結(jié)果為完全純化的病毒命名為P2。接種P2于Sf9單層細(xì)胞上，4d后收獲病變細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，表達(dá)產(chǎn)物BHA2融合蛋白分子量約為27KU，與理論值相符。該表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting和Dot-ELISA結(jié)果表明其可與雞抗H9N2亞型血清發(fā)生特異性抗原反應(yīng)，而與H5和H7亞型抗血清間無交叉反應(yīng)。 同時(shí)參照畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)p

4、PIC9K質(zhì)粒圖譜設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出HA2基因，命名為YHA2。將其克隆至畢赤酵母轉(zhuǎn)移載體pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ之間的多克隆位點(diǎn)上構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-YHA2。將其salⅠ線性酶切，電轉(zhuǎn)化將其整合到畢赤酵母菌GS115染色體上，利用MD平板篩選His+陽性克?。挥煤煌瑵舛菺418-YPD平極篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子；利用PCR法篩選Mut+陽性克隆。將篩選到的高拷貝進(jìn)行BMMY搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-