H9N2亞型豬流感病毒HA基因的遺傳演化與真核表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、本文通過對(duì)2004年和2005年流感調(diào)查分離到的14株H9N2亞型豬流感病毒進(jìn)行病毒HA基因序列測(cè)定與分析，研究了我國現(xiàn)存流行的H9N2亞型豬流感病毒變異狀況，然后挑選同源性較高的一株病毒，將其HA基因克隆到PCAGG真核表達(dá)載體上，構(gòu)建基因疫苗，進(jìn)行體外表達(dá)試驗(yàn)，然后將基因疫苗免疫BALB/C小鼠，檢測(cè)小鼠抗體生成情況及攻毒后保護(hù)情況。首先將分離到的14株病毒進(jìn)行純化，增殖后提取病毒RNA。在通用引物作用下37℃水浴進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增病

2、毒的cDNA，再在以O(shè)ligo6.0軟件設(shè)計(jì)的H9N2SIVHA基因片段特異PCR引物作用下，用高保真聚合酶經(jīng)PCR擴(kuò)增出病毒HA基因，將HA基因克隆到pMD18-T載體上，然后進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)得的序列用DNAStar軟件中的Seqman拼接所有序列，應(yīng)用MegAlign進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析。根據(jù)比較結(jié)果，選擇A/Swine/Zhejiang/1/04(H9N2)毒株，將其HA基因克隆到pMD18-T載體上，進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒

3、定，挑選HA基因正向克隆到pMD18-T載體上的陽性質(zhì)粒，然后采用SacⅠ、SphⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，酶切處理pMD18-T/HA陽性質(zhì)粒，膠回收備用；同樣用SacⅠ、SphⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，酶切處理PCAGG載體，膠回收備用；然后將均經(jīng)過酶切處理的載體、HA基因用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂板，篩選陽性菌落。將篩選的疑似陽性進(jìn)行PCR鑒定、多酶切鑒定(一般選擇三種或三種以上限制性內(nèi)切酶進(jìn)

4、行酶切鑒定)，將PCR鑒定、多酶切鑒定正確的菌液，用eppendorf轉(zhuǎn)染質(zhì)粒提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；之后將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與脂質(zhì)體經(jīng)OPTi-MEM(R)Ⅰ稀釋后按一定比例混合，轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，待48h后，收獲細(xì)胞，進(jìn)行處理，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞、正常293T細(xì)胞裂解后制備的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上用H9亞型禽流感病毒特異性多克隆血清做為一抗，、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗雞IgG為二抗，進(jìn)行Wes

5、ternblot檢測(cè)構(gòu)建質(zhì)粒所表達(dá)的HA基因蛋白。通過Westernblot檢測(cè)，證明所構(gòu)建質(zhì)粒能很好表達(dá)HA基因蛋白，然后大量提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒按不同劑量(10μg、100μg)，免疫BALB/C小鼠，初免三周后加強(qiáng)免疫一次，采取免疫前，免疫后第三周(加強(qiáng)免疫前)、加強(qiáng)免疫后兩周、攻毒后第6d的小鼠血清，采用HI試驗(yàn)檢測(cè)抗體水平；攻毒后6d、9d、12d各剖殺1/3小鼠，采集小鼠肺臟，研磨處理后進(jìn)行病毒滴定，檢測(cè)疫苗保護(hù)情況。疫苗免疫結(jié)