SIgMλ輕鏈的基因沉默對(duì)IBDV結(jié)合DT40細(xì)胞的影響.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞的傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的傳染性免疫疾病。雞的法氏囊是該病毒侵染的靶器官，主要是膜表面可以表達(dá)SIgM的法氏囊前B淋巴細(xì)胞。研究表明，SIgMλ輕鏈?zhǔn)荌BDV感染法氏囊細(xì)胞時(shí)的一個(gè)重要結(jié)合位點(diǎn)。但SIgMλ輕鏈基因在IBDV感染雞法氏囊細(xì)胞的過程中的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。
　　 為了深入研究SIgMλ輕鏈基因在IBDV感染雞法氏囊細(xì)胞中的基因功能，本研究利用RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)了一個(gè)可

2、以特異性抑制SIgMλ輕鏈基因表達(dá)的表達(dá)載體pAnGH1—shCRL。將該載體轉(zhuǎn)染DF—1細(xì)胞和DT40細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)和RT—PCR等技術(shù)鑒定了SIgMλ輕鏈基因的表達(dá)情況；并利用病毒感染實(shí)驗(yàn)鑒定了IBDV感染表達(dá)pAnGH1—shCRL基因序列的DT40細(xì)胞的情況。
　　 為了構(gòu)建可以在細(xì)胞內(nèi)特異性抑制SIgMλ輕鏈基因表達(dá)的RNAi載體，在分析了SIgMλ輕鏈的基因序列后，以pCDNA3．1(+)載體為骨架，將SV40

3、啟動(dòng)子改變?yōu)殡u源的β—actin啟動(dòng)子形成用于驅(qū)動(dòng)新霉素抗性基因(Neomycin)表達(dá)；同時(shí)裝入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因表達(dá)框以及用于啟動(dòng)shRNA轉(zhuǎn)錄的H1啟動(dòng)子，構(gòu)建了一個(gè)具有EGFP綠色熒光標(biāo)記和新霉素抗性，同時(shí)可以靶向干擾SIgMλ輕鏈基因表達(dá)的共表達(dá)載體pAnGH1—shCRL。該載體不僅可以用來標(biāo)記和追蹤被轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞，而且還可以用于持續(xù)轉(zhuǎn)錄shRNA的基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選。
　　 流式細(xì)胞術(shù)、RT

4、—PCR等結(jié)果顯示：同對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pAnGH1—shCRL載體的DT40細(xì)胞與SIgMλ輕鏈的特異性單抗L1的結(jié)合明顯下降，SIgMλ輕鏈基因的表達(dá)受到抑制，并且該細(xì)胞與IBDV的結(jié)合率也明顯降低。這說明pAnGH1—shCRL表達(dá)載體可以在DT40細(xì)胞內(nèi)特異性的干擾SIgMλ輕鏈基因的表達(dá)。利用pAnGH1—shCRL表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DT40細(xì)胞，在G4．18抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選并利用有限稀釋法挑取單克隆，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和功

5、能性鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示得到的單克隆細(xì)胞經(jīng)過多次的傳代后，pAnGH1—shCRL載體仍然能夠持續(xù)表達(dá)并對(duì)SIgMλ輕鏈基因的表達(dá)進(jìn)行特異性的抑制。結(jié)果表明構(gòu)建的pAnGH1—shCRL共表達(dá)載體的RNAi效果是高效的。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)成功獲得了SIgMλ輕鏈基因持續(xù)沉默的單克隆細(xì)胞株，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了SIgMλ輕鏈?zhǔn)荌BDV與DT40細(xì)胞的一個(gè)重要結(jié)合位點(diǎn)，SIgM九輕鏈基因的表達(dá)與否可以影響IBDV與DT40