PPARγ基因沉默對細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用.pdf

1、炎癥，作為與人類多種疾患息息相關(guān)的病理過程而備受國際醫(yī)學(xué)界的矚目，目前仍是臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的重要課題。業(yè)已研究證實(shí)，過度炎癥反應(yīng)是創(chuàng)傷后多種并發(fā)癥，如膿毒癥/膿毒性休克、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能不全綜合征等的重要病理基礎(chǔ)。為此，我們已從效應(yīng)細(xì)胞表面膜受體、細(xì)胞內(nèi)信號通路、靶基因表達(dá)調(diào)控、效應(yīng)細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)的關(guān)系四方面研究炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制和關(guān)鍵的調(diào)控環(huán)節(jié)，并在此基礎(chǔ)上尋找新的抗炎措施。近五年來，我們不僅在揭示創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)發(fā)

2、生機(jī)制方面取得一定的進(jìn)展，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體自身的抗炎保護(hù)效應(yīng)機(jī)制也是影響炎癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重創(chuàng)傷早期，體內(nèi)單核細(xì)胞合成促炎介質(zhì)能力明顯增強(qiáng)，但隨后卻明顯受抑，細(xì)胞產(chǎn)生抗炎介質(zhì)如IL-1Ra、IL-10無明顯減少?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為，炎癥應(yīng)是一個(gè)促炎與抗炎反應(yīng)相互依存、互為拮抗的復(fù)雜過程，伴隨炎癥產(chǎn)生的各種內(nèi)源性抗炎保護(hù)效應(yīng)機(jī)制固然是機(jī)體在炎癥環(huán)境下得以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的根本需要，但抗炎機(jī)制的失調(diào)，不僅是

3、促使早期有限性保護(hù)性炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)化為破壞性過度炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制，同時(shí)也是造成創(chuàng)傷機(jī)體免疫力低下、對感染易感性增加的重要原因。然而，對于機(jī)體自身調(diào)控抗炎反應(yīng)的機(jī)制，迄今尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。 近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptors，PPARs)通過反式阻抑機(jī)制對細(xì)胞的促炎反應(yīng)具有明顯的抑制作用。PPARs有三種異構(gòu)體：PPARα、PPARβ/δ和

4、PPARγ，在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等廣泛表達(dá)。早期研究認(rèn)為，它們在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARs也是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)(checkpoint)。有關(guān)PPARγ抗炎作用研究發(fā)現(xiàn)：PPARγ激動劑能明顯抑制炎性刺激誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(TNFα、IL1、IL6、NO)的產(chǎn)生；PPARγ配體預(yù)處理野生型動物，能明顯降低組織內(nèi)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕炎癥局部和遠(yuǎn)隔部位的組織損傷，對多種實(shí)驗(yàn)性

5、炎性疾病，如急性心肌炎、自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化等均顯示較好的治療作用；然而，PPARγ基因敲除可導(dǎo)致胚胎死亡，目前尚無PPARγ缺陷動物，僅有通過同源重組建立的PPARγ+/-嵌合小鼠模型。關(guān)于PPARγ對細(xì)胞其它抗炎保護(hù)效應(yīng)的調(diào)控作用，迄今文獻(xiàn)報(bào)道甚少。鑒于PPARγ在抗炎反應(yīng)方面的獨(dú)特作用機(jī)制，即通過反式結(jié)合，作用于多種核轉(zhuǎn)錄因子或/和胞漿輔蛋白。我們認(rèn)為炎癥發(fā)生過程中PPARγ不僅調(diào)控促炎介質(zhì)的合成，也可能影響抗炎介質(zhì)產(chǎn)生

6、，是維持細(xì)胞促炎與抗炎反應(yīng)動態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是Fire等在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的，隨后在果蠅、昆蟲、植物、哺乳動物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。所謂RNAi是指雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在體內(nèi)被切割為21-25nt(nucleotide)的小片段，這種小的雙鏈RNA可特異性識別其互補(bǔ)mRNA，促使其降解，使相關(guān)基因處于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-tra

7、nscriptionalgenesilencing，PTGS)，從而使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。RNAi與基因敲除或同源重組技術(shù)相比，其操作簡單、成本低廉，與反義技術(shù)相比，對基因表達(dá)的抑制更特異、更有效。因此，采用RNAi技術(shù)研究候選基因的功能以及基因治療實(shí)驗(yàn)已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。 鑒于PPARγ對多種重要轉(zhuǎn)錄因子的反式作用特點(diǎn)，本研究在明確PPARγ自身表達(dá)變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，利用RNAi表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建插入P

8、PARγ目的序列的pSUPER-EGFP重組質(zhì)粒；通過轉(zhuǎn)染沉默效應(yīng)最佳的重組質(zhì)粒，觀察PPARγsiRNA對RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用，并在此基礎(chǔ)上，深入研究PPARγ對炎癥反應(yīng)，特別是細(xì)胞抗炎保護(hù)效應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，旨在深入闡明PPARγ在維持細(xì)胞促炎與抗炎反應(yīng)動態(tài)平衡中的重要作用，以期進(jìn)一步揭示細(xì)胞自身對抗炎反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，并為深化炎癥的相關(guān)研究提供新思路。 主要結(jié)果如下：1.LPS呈時(shí)間依賴性地刺激RAW2

9、64.7巨噬細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)，且以PPARγ胞漿蛋白增加為主，細(xì)胞核PPARγ蛋白表達(dá)水平變化不明顯，僅在LPS刺激16h有一過性下調(diào)(P＜0.01)。在觀察時(shí)間內(nèi)，PPARγ胞漿與胞核蛋白比值呈不斷增加趨勢，LPS刺激5h后，比值高于對照組(P＜0.05)，這表明LPS刺激后不僅胞漿PPARγ蛋白表達(dá)增加，而且影響其在胞核與胞漿的再分布。 2.姜黃素能夠顯著增加RAW264.7細(xì)胞胞漿內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)，且PPARγ胞

10、核蛋白亦呈上調(diào)趨勢，PPARγ胞漿與胞核蛋白比值隨刺激時(shí)間延長比值不斷增加。提示，姜黃素不僅能夠上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)，而且能夠促進(jìn)胞漿PPARγ蛋白遷移到胞核。 3.在姜黃素預(yù)刺激后，LPS刺激能夠增加RAW264.7細(xì)胞PPARγ蛋白在胞漿、胞核內(nèi)的含量，且胞核PPARγ蛋白表達(dá)在LPS刺激12、16、24h高于同時(shí)間點(diǎn)LPS組胞核PPARγ蛋白表達(dá)水平(P＜0.05，P＜0.01)，PPARγ蛋白的胞漿與胞核比值在LPS刺

11、激3h后，顯著高于對照組(P＜0.01)，隨觀察時(shí)間后移呈上調(diào)趨勢。這表明，姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)LPS對PPARγ蛋白由胞漿向胞核遷移的抑制作用。 4.在RNA干擾重組質(zhì)粒構(gòu)建中，通過優(yōu)化靶序列篩選及構(gòu)建條件，成功構(gòu)建了四種PPARγ-pSUPER-EGFP，四種質(zhì)粒對PPARγ基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均有不同程度的抑制作用，且以重組質(zhì)粒2對PPARγ基因的沉默效應(yīng)最顯著(P＜0.01)。 5.LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞p

12、42/44MAPK磷酸化水平顯著增加，但在PPARγ基因沉默后，LPS刺激時(shí)p42/44MAPK磷酸化水平與沉默前比較無明顯變化(P＞0.05)。LPS刺激后IkappaB-alpha表達(dá)顯著減少(P＜0.01)，PPARγ基因沉默后，LPS刺激時(shí)IkappaB-alpha降解的速度和幅度均顯著高于沉默前LPS組(P＜0.01)。姜黃素預(yù)刺激能夠顯著抑制LPS刺激后RAW264.7巨噬細(xì)胞IkappaB-alpha的降解過程，PPARγ

13、基因沉默后，姜黃素在一定程度上，仍然能夠抑制LPS刺激后IkappaB-alpha降解。 6.LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞TNFα和IL-1Ra表達(dá)水平增加，但TNFα表達(dá)高峰時(shí)間較IL-1Ra靠前。姜黃素能夠顯著抑制LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞TNFα表達(dá)。PPARγ基因沉默后，姜黃素對LPS刺激時(shí)RAW264.7細(xì)胞TNFα表達(dá)的抑制顯著減弱。不同劑量的羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞TNFα表達(dá)僅有一定

14、程度的抑制作用，PPARγ基因沉默后，羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞TNFα表達(dá)與PPARγ基因沉默前比較沒有差異(P＞0.05)。 7.姜黃素對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞IL-1Ra表達(dá)水平無顯著影響，PPARγ基因沉默后，姜黃素對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞IL-1Ra表達(dá)與PPARγ基因沉默前比較亦無差異(P＞0.05)。不同劑量的羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞IL-1Ra表達(dá)增加。PPA

15、Rγ基因沉默后，不同劑量羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞IL-1Ra表達(dá)仍然呈增加趨勢，在刺激8h，IL-1Ra表達(dá)顯著高于對照組，而與PPARγ基因沉默前相應(yīng)對照組比較沒有差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1.LPS刺激后，RAW264.7巨噬細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)增加主要集中在細(xì)胞漿內(nèi)，姜黃素不僅能夠上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)，促進(jìn)PPARγ蛋白由胞漿遷移到胞核，還可以逆轉(zhuǎn)LPS對PPARγ蛋白由胞漿向胞核遷移的抑制作用，

16、有效調(diào)節(jié)PPARγ蛋白表達(dá)及其在胞漿/胞核的分布是調(diào)控RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。 2.在RNA干擾重組質(zhì)粒構(gòu)建中，靶序列篩選及構(gòu)建條件的優(yōu)化為以質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾研究提供了參考，所建重組質(zhì)粒不僅為PPARγ功能缺陷細(xì)胞系的建立提供了條件，也為PPARγ基因功能研究及相關(guān)疾病的基因治療提供了細(xì)胞模型。四種PPARγ-pSUPER-EGFP質(zhì)粒對PPARγ基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均有不同程度的抑制作用，且以重組質(zhì)粒2

17、對PPARγ基因的沉默效應(yīng)最顯著。 3.LPS刺激后，RAW264.7巨噬細(xì)胞通過PPARγ介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)并不改變ERK細(xì)胞信號通路的激活狀態(tài)，而是通過減少IkappaB-alpha磷酸化和降解，抑制NF-κB的激活與核轉(zhuǎn)位。姜黃素介導(dǎo)的PPARγ依賴性的抗炎效應(yīng)包括對NF-κB信號通路的拮抗作用，但PPARγ可能并不是其唯一的信號通路分子，其他下游信號通路分子可能通過非PPARγ依賴性途徑發(fā)揮抗炎效應(yīng)，PPARγ僅是姜黃素發(fā)揮

18、抗炎效應(yīng)的靶分子之一。 4.RAW264.7細(xì)胞促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)可能具有序貫性的特點(diǎn)，姜黃素上調(diào)并激活PPARγ的表達(dá)與LPS刺激后TNFα表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與IL-1Ra表達(dá)無關(guān)。PPARγ配體羅格列酮對RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的拮抗與IL-1Ra表達(dá)增加相關(guān)，且羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞IL-1Ra表達(dá)的干預(yù)呈PPARγ非依賴性。選擇姜黃素與PPARγ配體伍用的抗炎策略對于巨噬細(xì)胞過度炎癥反應(yīng)的調(diào)控可