P16基因沉默及對(duì)人毛乳頭細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:基因沉默(Gene Silencing)是真核生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種手段。基因沉默有多種方法，RNA干擾（RNA interference，RNAi）現(xiàn)象是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，即由內(nèi)源性或外源性同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的目的mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。人毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells，DPCs)是一簇間充質(zhì)細(xì)胞位于毛囊基底部，也是一種特化的成纖維細(xì)胞，

2、其對(duì)毛囊的誘導(dǎo)和分化有重要作用。研究表明毛乳頭細(xì)胞這種作用與其在體內(nèi)外成特征性凝集性生長(zhǎng)有密切的關(guān)系，體外實(shí)驗(yàn)證明，毛乳頭細(xì)胞會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸失去其凝集性生長(zhǎng)的特性，細(xì)胞傳代至7、8、9代時(shí)這種特征性的凝集性生長(zhǎng)基本消失，隨著此特性消失，毛乳頭細(xì)胞對(duì)毛囊形態(tài)學(xué)的影響及生長(zhǎng)周期的調(diào)控作用也逐漸消失，從而導(dǎo)致了斑禿等毛發(fā)疾病的發(fā)生。P16基因?yàn)榧?xì)胞周期調(diào)控因子，其主要通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白激酶4(cyclindependent ki

3、nase，CDK4)而發(fā)揮作用，主要功能使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期受阻，從而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，高傳代的毛乳頭細(xì)胞中P16蛋白的表達(dá)量較低傳代的毛乳頭細(xì)胞中高，P16基因可能與細(xì)胞衰老有關(guān)。毛乳頭細(xì)胞高傳代時(shí)失去其特征性的凝集性生長(zhǎng)，細(xì)胞周期延長(zhǎng)，P16蛋白表達(dá)量增加，考慮將將P16基因沉默后，毛乳頭細(xì)胞能否延遲衰老，或恢復(fù)其特征性凝集性生長(zhǎng)，從而恢復(fù)對(duì)毛囊的調(diào)控作用，為毛發(fā)疾病，特別是斑禿的治療提供新的方法？
　　方

4、法:
　　1實(shí)驗(yàn)分組
　　將購(gòu)得的人毛乳頭細(xì)胞隨機(jī)分為三組，分別為基因沉默組、陰性對(duì)照組和正常組。
　　2人毛乳頭細(xì)胞的RNA干擾。
　　將復(fù)蘇后的毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)于專(zhuān)用MSCM培養(yǎng)基中，并置于37℃、適宜濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)60％-70％后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，于基因沉默組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中分別加入含有適量的病毒顆粒的無(wú)血清培養(yǎng)基，4小時(shí)后，更換為MSCM培養(yǎng)基，待溫箱內(nèi)放置48小時(shí)后，

5、于熒光顯微鏡下觀察人毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。
　　3倒置相差顯微及電鏡下觀察，不同組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)的不同。
　　4 MTT法測(cè)不同組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
　　5 PCR方法檢測(cè)不同組細(xì)胞P16基因mRNA的表達(dá)量，內(nèi)參照為甘油醛-3磷酸脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。
　　6用免疫熒光法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組細(xì)胞的P16蛋白的表達(dá)異。

6、
　　7流式細(xì)胞儀測(cè)定基因沉默后不同組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡。
　　8運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和處理。
　　結(jié)果:
　　1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大約為70％-80％，符合實(shí)驗(yàn)要求(Fig.2-2)。
　　2倒置相差顯微鏡及電鏡下觀察，P16基因沉默組及陰性對(duì)照組較正常組有較多的核分裂，及細(xì)胞表面的顆粒樣物質(zhì)(Fig.2-3、Fig.2-4)。
　　3 MTT法測(cè)定不同時(shí)間不同組細(xì)胞吸光度值改

7、變，從而繪制出各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果（Fig.2-5、Table2-3）正常組第1-5天的吸光度分別為0.196±0.030、0.266±0.048、0、325±0.027、0.369±0.045、0.465±0.057;陰性對(duì)照組為0.164±0.039、0.283±0.063、0.314±0.064、0.406±0.075、0.437±0.070;基因沉默組為0.206±0.047、0.253±0.033、0.359±0.081、

8、0.519±0.079、0.536±0.052。
　　4普通PCR結(jié)果顯示內(nèi)參照組的亮度基本相同，實(shí)驗(yàn)組基因沉默組的亮度明顯暗于陰性對(duì)照組和基因沉默組(Fig.2-7)，Q-PCR結(jié)果顯示表示P16基因mRNA的含量的RQ值基因沉默組為0.04±0.007;陰性對(duì)照組為0.66±0.356;正常組為1(Fig.2-8、Table2-2)。
　　5免疫熒光法測(cè)定不同組細(xì)胞P16蛋白表達(dá)量結(jié)果顯示基因沉默組熒光量最弱，陰性對(duì)照組

9、熒光量與正常組熒光量比基因沉默組強(qiáng)(Fig.2-10)。
　　6流式細(xì)胞儀測(cè)定3組細(xì)胞P16蛋白表達(dá)量結(jié)果為，所得到的FI值基因沉默組4代細(xì)胞為2.43±0.02，8代細(xì)胞為2.04±0.06;陰性對(duì)照組4代細(xì)胞為2.25±0.03，8代細(xì)胞為1.91±0.07;基因沉默組4代細(xì)胞為1.27±0.31，8代細(xì)胞為1.2±0.05(Fig.2-10、Table2-4)。
　　7流式細(xì)胞儀測(cè)定3組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率，測(cè)定細(xì)胞

10、凋亡率結(jié)果為基因沉默組為8.92±0.61，陰性對(duì)照組為4.35±0.05，正常組為2.86±0.07;測(cè)定細(xì)胞周期時(shí)G1％基因沉默組為57.8±4.38，陰性對(duì)照組為68±1.27，正常組為82.1±0.99;S％含量基因沉默組為45.1±1.27;陰性對(duì)照組為26.7±0.71，正常組為8.6±4.45(Fig.2-11、Table2-5)。
　　結(jié)論:
　　1 P16基因可能通過(guò)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。