NaCl脅迫下甘草子葉愈傷組織高產(chǎn)黃酮細(xì)胞系的篩選及其RNA提取.pdf

1、甘草是我國最常用的藥材，在中藥處方中地位極高，而且既可以藥用也可以食用。目前被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品、醫(yī)藥的行業(yè)，年需求量大。近年來由于人們對野生甘草狂挖濫采，野生甘草遭到毀滅性破壞，人工種植的甘草因諸多客觀條件限制使得甘草產(chǎn)量和質(zhì)量均不理想，進(jìn)而影響到甘草的藥用價(jià)值。目前，從本質(zhì)上改善甘草藥材質(zhì)量是亟待解決的關(guān)鍵問題。
　　本研究以脹果甘草子葉愈傷組織為材料，以不同濃度NaCl進(jìn)行脅迫處理，研究了NaCl脅迫對脹果甘草子

2、葉愈傷組織生長量、生理指標(biāo)和黃酮含量的影響，篩選出甘草黃酮高產(chǎn)細(xì)胞系。用相同方法和條件對脹果甘草無菌苗做了脅迫處理，結(jié)果表明甘草無菌苗的生長狀態(tài)、生理指標(biāo)和黃酮含量等與85.5mmol/LNaCl濃度脅迫下的甘草黃酮高產(chǎn)細(xì)胞系的各種指標(biāo)變化趨勢基本一致。對獲得的甘草黃酮高產(chǎn)細(xì)胞系進(jìn)行了特征分析。用改良的Trizol法提取了黃酮高產(chǎn)細(xì)胞系總RNA以及未經(jīng)NaCl處理的對照組愈傷組織的總RNA，為下一步用SSH法構(gòu)建cDNA差減文庫提供了所

3、需的RNA，為揭示甘草黃酮合成機(jī)制和代謝途徑相關(guān)功能基因的分離做了前期準(zhǔn)備。主要研究結(jié)果包括：
　?。?）對脹果甘草子葉愈傷組織的相對生長量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，42.7mmol/L的NaCl能促進(jìn)脹果甘草子葉愈傷組織的生長。85.5mmol/L的NaCl是脹果甘草子葉愈傷組織的閾值，超過閾值后，甘草子葉愈傷組織的生長明顯被抑制，材料嚴(yán)重褐化、水漬化。
　　（2）用NaCl脅迫脹果甘草子葉愈傷組織的方法篩選出了甘草黃酮高產(chǎn)細(xì)胞

4、系，并對甘草黃酮高產(chǎn)細(xì)胞系進(jìn)行了特征分析。結(jié)果表明當(dāng)NaCl濃度為85.5mmol/L時(shí)，脹果甘草子葉愈傷組織的黃酮含量明顯升高，黃酮含量動(dòng)態(tài)分析表明在培養(yǎng)第28d左右黃酮含量達(dá)到最大值，在鹽脅迫28d和35d時(shí)，其黃酮含量極顯著高于未經(jīng)鹽處理的對照組（p＜0.01），分別增加了0.1mg/g和0.16mg/g。85.5mmol/LNaCl脅迫下的脹果甘草子葉愈傷組織在固體MS繼代培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出“S”型生長曲線，其適應(yīng)期與42.7mmo

5、l/L的NaCl處理組明顯延長，在第30d左右對數(shù)生長末期的細(xì)胞生長狀態(tài)仍很活躍，細(xì)胞呈現(xiàn)圓形，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核明顯，適合愈傷組織的繼代培養(yǎng)。85.5mmol/LNaCl脅迫下的脹果甘草子葉愈傷組織中的PAL活性顯著（p＜0.05）高于對照組。
　　（3）以85.5mmol/LNaCl處理的黃酮高產(chǎn)細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)組，以未經(jīng)NaCl處理的脹果甘草子葉愈傷組織為對照組，用改良的Trizol法提取脹果甘草子葉愈傷組織的總RNA，電泳檢測