甘草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系建立與鹽脅迫差減cDNA文庫構(gòu)建.pdf

1、甘草是中藥中最常用的藥材之一。人工種植的甘草因諸多客觀條件限制使得甘草所含有的主要藥用次生代謝產(chǎn)物含量很低,進(jìn)而影響到甘草的藥用價(jià)值。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,通過生物工程技術(shù)來調(diào)控甘草次生代謝途徑,從而提高其有效成分含量成為一種有效的方法。
　　本實(shí)驗(yàn)室篩選的脹果甘草愈傷組織生長速度快,遺傳穩(wěn)定性強(qiáng),甘草黃酮、甘草多糖等次生代謝產(chǎn)物含量高,在振蕩培養(yǎng)條件下可以形成穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系,適合于甘草次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的相關(guān)研究。脹果

2、甘草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系及其鹽脅迫下差減文庫的構(gòu)建為獲得目的基因和目的基因?qū)敫什菁?xì)胞,以及甘草次生代謝途徑中生物合成相關(guān)基因的分離與鑒定和進(jìn)一步利用基因工程手段調(diào)控甘草次生代謝產(chǎn)物的生物合成研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系。EHA105和LBA4404兩種根癌農(nóng)桿菌菌株都含有植物表達(dá)載體pBI121-gfp,該質(zhì)粒上攜帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)和綠色熒光蛋白基因(gfp)。設(shè)置不

3、同培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織作為受體材料和農(nóng)桿菌不同侵染時(shí)間兩組條件,對脹果甘草愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系建立研究,并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。最佳轉(zhuǎn)化條件為:繼代培養(yǎng)7d的愈傷組織作為受體材料,用含有pBI121-gfp植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌 EHA105菌株侵染15min,共培養(yǎng)3d后,Kan100mg/L篩選培養(yǎng)篩選45d獲得轉(zhuǎn)化的愈傷組織,轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到97.14％。
　　本研究以脹果甘草愈傷組織為材料,通過抑制性消減雜交技術(shù)(SSH),

4、構(gòu)建了其鹽脅迫下的正反向差減文庫。比較以Primer1為引物的第一次PCR及巢式引物第二次PCR擴(kuò)增結(jié)果,以及藍(lán)白斑篩選出陽性克隆最終得到質(zhì)量合格的差減文庫。共獲得983個(gè)陽性克隆,文庫重組率為85.7%。選取60個(gè)陽性克隆測序,EST序列分析結(jié)果顯示:可能具有功能的基因約為75%。這些基因與白云杉(mRNA)、大麥(韌皮部蛋白)、玉米(泛素)和小麥等高度同源,參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)合成等多個(gè)生物學(xué)過程,表明甘草愈傷組織鹽抗性基因與數(shù)據(jù)庫