萱草愈傷組織芽分化培養(yǎng)基的篩選[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　萱草愈傷組織芽分化培養(yǎng)基的篩選</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物工程 <

2、/p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　摘 要</b></p><p

3、>　　在本實(shí)驗(yàn)中以萱草花梗莖段為試驗(yàn)試材,以MS為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度的BA和NAA來(lái)確定最佳的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基和叢生芽增殖的培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明:MS + BA 0.5mg/L + NAA 0.1mg/L的固體培養(yǎng)基,有很好的誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織的效果。</p><p>　　關(guān)鍵詞：萱草；愈傷組織；芽分化</p><p>　　Screening culture medi

4、um of callus inducement and shoot differentiation of Hemerocallis in Vitro</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　The experiments were used the stem of Hemerocallis fulva as test plant. T

5、he MS as culture medium were each added different concentration BA and NAA. The results of experiments: MS solid culture medium added BA 0.5mg/L and NAA 0.1mg/L had good induced effect to explantation growth callus and t

6、he next-generation culture.</p><p>　　Keyword: Hemerocallis ；callus ；bud initiation</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

7、．．．．．．．．．．．．．．．．．．．Ⅰ</p><p>　　ABSTRACT．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．Ⅱ</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

8、．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1</p><p>　　1.2 萱草的傳統(tǒng)繁殖方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．.．．．．2</p><p>　　1.3 萱草的現(xiàn)代繁殖方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2&

9、lt;/p><p>　　1.3.1 植物組織培養(yǎng)和芽分化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．...2</p><p>　　1.3.2 萱草的組織培養(yǎng)．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4</p><p>　　2 材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

10、．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5</p><p>　　2.1 材料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5</p><p>　　2.1.1 試驗(yàn)材料5</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品5</p&

11、gt;<p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器6</p><p>　　2.2 方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6</p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基的制備6</p><p>　　2.2.2 萱草外植體處理6</p><p>　

12、　2.2.3 接種及培養(yǎng)7</p><p>　　2.2.4 培養(yǎng)條件8</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析8</b></p><p>　　3.1 不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率與成活率的影響．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10</p><p>　　3.2 不同激素組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響．．．．．

13、．．．．．．．．．............．．.．....．．．11</p><p>　　3.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)叢生芽增殖培養(yǎng)的影響．．．．．．．．．．．．．．．．．...．...．．．13</p><p>　　4 討論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14</p>

14、<p>　　4.1 萱草植物組織培養(yǎng)中的滅菌操作．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14</p><p>　　4.2 萱草植物組織培養(yǎng)中對(duì)植物激素的選擇．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15</p><p>　　4.3 萱草植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的選擇．．．．．．．．．．．．．．．．

15、．．．．．．．．．15</p><p>　　致謝．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．16</p><p>　　參考文獻(xiàn)．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17</p>

16、<p><b>　　1 緒論</b></p><p><b>　　1.1 概述</b></p><p>　　萱草系百合科多年生草本植物。以根及根莖入藥,為我國(guó)傳統(tǒng)中藥“萱草根”,具有清熱涼血、利尿通淋的功效,用于治療水腫、小便不利、淋濁、帶下、黃疸、便血、崩漏等癥【1-2】。萱草不僅具有藥用價(jià)值,還具有花卉觀賞和蔬菜食用價(jià)值。萱草葉狹

17、長(zhǎng),花呈喇叭形, 花莖變化大, 花形各異, 花期從晚春一直到秋季, 盛花期可延續(xù)幾個(gè)月,被廣泛用于綠化工程。它不僅供人觀賞, 也可將花蕾作蔬菜供人食用, 其花經(jīng)過加工后是頗負(fù)盛名的“黃花菜”、“金針菜”,營(yíng)養(yǎng)豐富,且具有保健益壽之功。新研究表明萱草根中含有多種蒽醌類和二氫呋喃- γ - 內(nèi)酰銨類化合物,這些成分具有抗菌、抗癌、殺蟲等生物活性 【3】。</p><p>　　萱草原產(chǎn)于亞、歐各國(guó)，萱草屬植物自歐洲南部

18、經(jīng)亞洲北部直至日本均有分布，屬?gòu)V布種，但主要分布于東亞，其分布區(qū)北緣大約在北緯50°～60°，分布區(qū)南緣在我國(guó)福建、廣東、廣西、云南及西藏東部地區(qū)。1753 年瑞典植物學(xué)家林奈建立萱草屬[7] ，萱草屬全世界約有14[6] ，1893 年，英國(guó)人GeorgeOyeld 登記注冊(cè)了第一個(gè)萱草栽培品種“Aprioot”，至今，園藝品種已多達(dá)萬(wàn)種以上[7] 。我國(guó)具有豐富的萱草屬植物資源，原產(chǎn)我國(guó)的有11 個(gè)種，從種的總數(shù)

19、及特有種數(shù)目看，我國(guó)是萱草屬現(xiàn)代分布多度中心和分化中心。我國(guó)關(guān)于萱草屬植物的記載最早見于《詩(shī)經(jīng)》，距今約兩千多年歷史,其栽培在我國(guó)起始于漢代，至明代中葉，被作為菜廣泛栽培，主要集中在我國(guó)長(zhǎng)江流域，目前南北各省均有種植 。中國(guó)萱草在中世紀(jì)時(shí)開始傳到歐洲，西北地區(qū)有6 種，集中在東北的有6 種[8] ，其中折葉萱草( H. plica2ta) 、西南萱草( H. f orrestii) 、矮萱草( H. nana) 和多花萱草( H. mu

20、lti f lora) 為中國(guó)特有種[9] 。至1890 年除個(gè)別種外，幾乎所有的萱草種都被引到歐</p><p>　　近百年來(lái)萱草屬植物的分類問題一直存在爭(zhēng)議，在長(zhǎng)期栽培過程中，其園藝雜交品種多，另有一些天然雜交種，出現(xiàn)種間外部形態(tài)高度相似、栽培種與野生種并存等因素，給分類帶來(lái)困難，尤其在對(duì)標(biāo)本鑒定時(shí)難度大。很可能發(fā)生標(biāo)本誤定，關(guān)于品種分類的數(shù)據(jù)難于統(tǒng)一比較。不同研究者有不同分類處理《中國(guó)植物志》記載全屬有14

21、 種，我國(guó)國(guó)產(chǎn)11 種；Hu S Y整理了本屬23種及若干變種，并以開花起始時(shí)間的變化范圍為區(qū)分萱草屬部分植物的依據(jù)，松岡通夫和掘田滿1966 年認(rèn)為有6 種；大井次三郎1969 年記載日本產(chǎn)9 種，《朝鮮植物圖鑒》收錄朝鮮產(chǎn)4 種，而《大韓植物圖鑒》記載有7 種。此外，在屬內(nèi)是否分組及分組數(shù)量等問題方面不同學(xué)者也有不同意見，Nakai 認(rèn)為日本萱草屬植物分6 組，并將中國(guó)萱草屬夜間開花植物分兩組，Matsuoka 等將我國(guó)產(chǎn)夜間開花萱

22、草處理為1 個(gè)組，亦有其他學(xué)者將其區(qū)分為若干獨(dú)立物種。Noguchi根據(jù)萱草分布的地理區(qū)域和形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類。熊治廷等根據(jù)核型、外部形態(tài)及地理分布資料的綜合分析，將北萱草與大苞萱草( H. mi ddendorf ii Trautv . etMey. )區(qū)分為不</p><p>　　1.2 萱草的傳統(tǒng)繁殖方法</p><p>　　萱草屬植物可采用播種、扦插、分株和組織培養(yǎng)等方法繁殖，常用

23、方法為分株和組織培養(yǎng)繁殖。萱草分生能力強(qiáng),可從根莖部發(fā)生多數(shù)萌蘗，分株繁殖是萱草屬植物常用而經(jīng)濟(jì)的繁殖方法。分株繁殖多在春季萌芽前或秋季落葉后進(jìn)行。分株繁殖在最短時(shí)間內(nèi)獲得有開花能力的植株，并能保持品種特性,但繁殖系數(shù)低,不適于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)。有關(guān)萱草屬植物組織培養(yǎng)的研究主要集中在食用黃花菜和多倍體萱草[12-14] 。自然界的1 株萱草一般靠分蘗繁殖每年僅能繁殖4～5 株。</p><p>　　扦插繁殖具有成本

24、低廉、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛推廣。萱草有些品種在花莖抽出后,自花莖中下部的節(jié)位上發(fā)生莖生芽,莖生芽可在花莖干枯前剝下扦插成苗[15]。但它也存在著以下不足：①采用莖段扦插的方法需耗費(fèi)大量的母本材料，周期長(zhǎng)，繁殖效率較低。用葉片進(jìn)行扦插會(huì)出現(xiàn)部分扦插苗地上部生長(zhǎng)緩慢的情況。②扦插不當(dāng)會(huì)對(duì)切口細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響,造成插穗的腐爛。③季節(jié)的不同導(dǎo)致的環(huán)境變化,對(duì)插材的生根成活率影響較大。④扦插容易感染病毒病。</p><p&

25、gt;　　分株繁殖較為常用，且植株容易存活。栽植地最好是地下水位低的平地或水源、灌溉條件好的坡地,排水良好、土質(zhì)疏松、土層深厚[16]。分株繁殖[17]一般在3月中旬和10月中下旬進(jìn)行。首先挖出株叢,再用刀將株叢分切成1至2個(gè)芽的小株,每小株需帶一定的根,切忌切傷生長(zhǎng)點(diǎn)。春天分株,夏季即可開花,只是花期略有推遲。秋季分株宜早不宜晚,上凍前澆好越冬水,以確保安全越冬。栽種時(shí)應(yīng)選擇晴天進(jìn)行，邊挖苗、邊分株、邊栽苗，盡量少傷根，有利于緩苗。一

26、般情況下2至3年分株1次,以保證有旺盛的生長(zhǎng)勢(shì)?？梢?，萱草分株繁殖能力不強(qiáng)、增殖速度慢，因而難以適應(yīng)市場(chǎng)商品化生產(chǎn)的需求。因此，尋求一種新的穩(wěn)定而高效的繁殖方法，對(duì)萱草具有重要意義。</p><p>　　1.3 萱草的現(xiàn)代繁殖方法</p><p>　　1.3.1 植物組織培養(yǎng)和芽分化</p><p>　　植物組織培養(yǎng)是以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一門新生的生物技術(shù)學(xué)

27、科。植物組織培養(yǎng)包括了所有類型的無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)， 主要有： 成熟及未成熟植物胚胎的離體培養(yǎng)； 離體器官包括根尖、 莖尖、 葉原基、 花器官原基或未成熟花器官各部分以及未成熟果實(shí)的培養(yǎng)；從植物各種器官的外殖體增殖而形成的愈傷組織培養(yǎng)； 能保持良好分散性的離體細(xì)胞或很小細(xì)胞團(tuán)的液體培養(yǎng)； 除去細(xì)胞壁的植物原生質(zhì)體培養(yǎng)。這一學(xué)科的建立和發(fā)展， 對(duì)植物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域如細(xì)胞學(xué)、 胚胎學(xué)、 遺傳學(xué)、 生理學(xué)、 生物化學(xué)、 植物病理學(xué)、 發(fā)育生物學(xué)等學(xué)

28、科的發(fā)展均有很大的促進(jìn)作用。廣泛應(yīng)用于植物的快速繁殖、植物品種改良、 基因工程育種、 種質(zhì)資源保存、 次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面， 對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)生了深刻影響?！?8】</p><p>　　在芽分化期，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定芽?jī)?nèi)4種內(nèi)源激素吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZRs)和脫落酸(ABA)含量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明：在芽生理分化期，GA和IAA含量有所增加，但在芽形態(tài)分化

29、開始以后GA的含量呈逐步下降趨勢(shì)，直至分化結(jié)束；ZRs含量在芽生理分化期呈上升趨勢(shì)，在形態(tài)分化前期含量出現(xiàn)高峰，進(jìn)入形態(tài)分化期后其含量下降；ABA含量在芽分化初期有逐步增加的趨勢(shì)，在達(dá)到最高水平后，至芽形態(tài)分化結(jié)束，ABA的含量呈逐步下降趨勢(shì)，但其變化相對(duì)平穩(wěn)。研究認(rèn)為芽分化期需要有高水平的ZRs、低水平的GA和IAA。</p><p>　?。ㄒ唬?植物脫毒技術(shù)</p><p>　　植物

30、脫毒技術(shù)往往與植物組培快繁技術(shù)結(jié)合在一起應(yīng)用。植物在發(fā)育過程中不可避免地會(huì)感染病毒， 解決此問題的一個(gè)重要途徑就是脫毒培養(yǎng)。在植物體內(nèi)， 病毒主要通過維管束組織進(jìn)行運(yùn)輸和擴(kuò)散， 莖尖新生的分生組織， 沒有維管束分化， 病毒難以到達(dá)， 因此病毒含量很低， 甚至沒有。所以采取莖尖培養(yǎng)可減少再生植株的病毒含量， 連續(xù)進(jìn)行幾代培養(yǎng)， 甚至可獲得無(wú)病毒植株， 使植物得以復(fù)壯。脫毒植株增加產(chǎn)量、 提高品質(zhì)的效應(yīng)非常明顯， 有廣闊的應(yīng)用前景。然而，

31、植物脫毒培養(yǎng)也存在一些技術(shù)上的問題。通常， 取莖尖【19】的分生組織進(jìn)行脫毒培養(yǎng)， 盡管有高倍顯微鏡幫助， 操作也很不易； 其次， 把這樣小的材料培養(yǎng)成再生植株也不是一件容易的事。此外， 有些病毒能夠侵入頂端分生組織， 對(duì)此材料需要用高溫處理等方法來(lái)殺死病毒， 更增加了組織脫毒培養(yǎng)的難度。在脫毒培養(yǎng)過程中， 病毒檢測(cè)是一道不可缺少的程序， 常用的方法有敏感植物法、 抗血清法。每種方法都有其局限性， 如敏感植物法需時(shí)間較長(zhǎng)。隨著植物組培脫

32、毒產(chǎn)業(yè)化的興起， 需要大量的病毒檢測(cè)， 所以開發(fā)出應(yīng)用簡(jiǎn)便， 用時(shí)少， 價(jià)格低，適用于多種病毒檢測(cè)的技術(shù)， 具有重要</p><p><b>　　（二） 滅菌</b></p><p>　　滅菌[21]就是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有有生命的物質(zhì)全部殺死。植物組織培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)

33、，稍不小心就引起雜菌污染。要達(dá)到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對(duì)象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時(shí)不受雜菌的影響，使組培苗能正常生長(zhǎng)。外植體的滅菌通常采用化學(xué)藥劑浸泡的方法。滅菌時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)傷害側(cè)芽，而時(shí)間過短，會(huì)因滅菌不徹底而引起污染。對(duì)一些容易污染、較難滅菌的外植體進(jìn)行滅菌時(shí)，用單一滅菌劑不能收到好的效果。所以有時(shí)候選用兩種滅菌劑交替浸泡法，這樣就可以保證常規(guī)的細(xì)菌被殺除。</p><p>　?。?/p>

34、三） 外植體的選擇</p><p>　　植物細(xì)胞具有全能性，通常認(rèn)為選擇植物合適的器官組織做為外植體，只要在合適的條件下培養(yǎng)，最終會(huì)經(jīng)過脫分化再分化成完整植株。</p><p>　　不同外植體的誘導(dǎo)分化能力不同,其中腳芽的誘導(dǎo)分化能力最好，花蕾次之，花莖的誘導(dǎo)分化能力次于花蕾，而花瓣的誘導(dǎo)分化能力最差。所以在選擇組織培養(yǎng)用的外植體時(shí)，要選擇花莖幼嫩的最上部。</p><

35、;p>　　四．植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用</p><p>　　1大規(guī)?？焖贌o(wú)性繁殖的植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，對(duì)植物生長(zhǎng)極為有利，生長(zhǎng)周期短，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年生產(chǎn)，而且能使不能或很難繁殖的植物進(jìn)行增殖。由于上述特點(diǎn)，加上組培苗的小型化，可使有限的空間培養(yǎng)出大量的植物。在選材消毒、接種培養(yǎng)、誘導(dǎo)篩選、繼代保存、分離鑒定等方面建立了一整套完整的技術(shù)方法，運(yùn)用組織培

36、養(yǎng)的方法可大大提高繁殖效率。【22】</p><p>　　2.藥用植物由于受到不良因素的影響，易退化和變種，影響品質(zhì)和產(chǎn)量。可利用組織培養(yǎng)選用優(yōu)良品種的藥用植物儲(chǔ)備足夠的活種質(zhì)，以便應(yīng)用它們來(lái)開發(fā)研制。</p><p>　　3培養(yǎng)無(wú)病的藥用植物品種，促進(jìn)良種栽培許多植物在自然生長(zhǎng)環(huán)境往往患有病毒，且代代相傳，嚴(yán)重影響中藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。采用微莖尖培養(yǎng)方法可得到無(wú)病毒苗后，微莖尖培養(yǎng)就成為解

37、決病毒病危害的重要途徑之一。若與熱處理相結(jié)合，則可提高脫毒培養(yǎng)的效果。組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗的方法已在很多作物的常規(guī)生產(chǎn)中得到應(yīng)用。而且已有不少地區(qū)建立了無(wú)病毒苗的生產(chǎn)中心，這對(duì)于無(wú)病毒苗的培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個(gè)規(guī)范的系統(tǒng)程序，從而達(dá)到了保持園藝植物的優(yōu)良種性和經(jīng)濟(jì)性狀的目的。</p><p>　　4.生產(chǎn)藥物活性成分隨著中藥在臨床的廣泛使用，特別是珍貴藥用植物資源匱乏、生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量低，難以滿

38、足臨床的需要，利用藥用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用活性成分來(lái)代替原植物。目前，進(jìn)行植物組織細(xì)胞培養(yǎng)研究的植物已達(dá)百余種，其中以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物研究的細(xì)胞工程近100多種，從組織細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的天然藥物活性成分有600種左右，包括生物堿、醌類、甾醇、皂苷、酶類等?！?3】 </p><p>　　1.3.2 萱草的組織培養(yǎng)</p><p>　　萱草屬植物組織

39、培養(yǎng)中花器官的出愈率較葉片高， 但其取材卻僅限于花季，有較大的局限性，以莖尖為外植體進(jìn)行大花萱草的組織培養(yǎng)，其出愈率較高，能快速繁殖，取材不受季節(jié)限制，這為快速繁殖良種或育種材料提供了一條可行的新途徑。利用大花萱草莖尖為外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)中培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，篩選出培養(yǎng)基?！?4】</p><p>　　王曉娟等將清洗干凈的萱草莖尖用自來(lái)水沖洗過夜，在無(wú)菌條件下，用75 %酒精消毒15 s ，再轉(zhuǎn)入0. 1 %升

40、汞溶液浸泡8 min，最后用無(wú)菌水沖洗4～5 次。用消毒的解剖刀將最外層的葉片剝?nèi)ズ?，從中間將莖尖縱向一切為二，切成1 cm左右的長(zhǎng)度，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。外植體接種到愈傷組織培養(yǎng)基上20 d 后，莖尖基部開始萌動(dòng),產(chǎn)生淡黃色愈傷組織。30 d 后，將老死褐化部分切除，新生愈傷組織連同外植體轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。將產(chǎn)生的愈傷組織塊每隔30 d 轉(zhuǎn)移一次，至有大量的愈傷組織塊產(chǎn)生。將淡黃色的愈傷組織塊切成小塊轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基

41、中。10 d 后，淡黃色的愈傷組織逐漸變綠，開始產(chǎn)生許多新生芽點(diǎn)，每個(gè)新生芽點(diǎn)均可成長(zhǎng)為一棵無(wú)根再生苗。叢生芽的增殖系數(shù)達(dá)4. 5 左右，芽體健壯,生長(zhǎng)迅速。在此培養(yǎng)過程中，每隔20～30 d 要轉(zhuǎn)接一次新鮮培養(yǎng)基，以保證愈傷組織和新生芽對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求。【25】</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料<

42、;/b></p><p>　　2.1.1 試驗(yàn)材料</p><p>　　試驗(yàn)材料為吉星萱草植株(圖2-1)。</p><p>　　圖2-1 試驗(yàn)用萱草植株</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品</p><p>　　HgCl2、NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2&#

43、183;2H2O、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2·MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2·EDTA·2H2O、瓊脂、蒸餾水、乙醇、氫氧化鉀、鹽酸、蔗糖、肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀

44、器</p><p>　　超凈工作臺(tái)、濾紙、培養(yǎng)皿、玻璃棒、pH計(jì)、燒杯、電磁爐、不銹鋼鍋、玻璃容器、鑷子、刀片、容量瓶等</p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基的制備</p><p>　?。?） MS基本培養(yǎng)基的配方</p><p>　　母液Ⅰ：N

45、H4NO3(33g/L)、KNO3(38g/L)、MgSO4·7H2O(7.4g/L)、KH2PO4(3.4g/L)</p><p>　　母液Ⅰ(Ca2+)：CaCl2·2H2O(8.8g/L)</p><p>　　母液Ⅱ：KI（0.166g/L）、H3BO3（1.24g/L）、MnSO4·4H2O（4.46g/L）、ZnSO4·7H2O（1.72g

46、/L）、Na2·MoO4·2H2O（0.05g/L）、CuSO4·5H2O（0.005g/L）、 CoCl2·6H2O（0.005g/L）</p><p>　　母液Ⅲ：FeSO4·7H2O(5.56g/L)、Na2·EDTA·2H2O(7.46g/L)</p><p>　　母液Ⅳ：肌醇(20g/L)、煙酸(0.1g/L

47、)、鹽酸吡哆醇(0.1g/L)、鹽酸硫胺素(0.1g/L)、甘氨酸(0.4g/L)</p><p>　?。?） 制備培養(yǎng)基的步驟</p><p>　　⑴ 在1000ml的大燒杯中加入蒸餾水約600ml，用移液槍分別加入母液Ⅰ100ml，母液Ⅰ（Ca2+）50ml，母液Ⅱ10ml，母液Ⅲ10ml，肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸各2ml；</p><p>

48、　?、?再在燒杯中加入適宜濃度所選擇的植物激素BA和NAA；</p><p>　?、?加入適量蒸餾水使定容到1000ml,將燒杯置于pH計(jì)上，放入磁珠，打開開關(guān)，使溶液攪拌均勻；</p><p>　?、?充分混合之后，用1mol/L NaOH和1mol/L HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值到5.8；</p><p>　?、?將混合溶液倒入不銹鋼鍋中，并加入稱出的4.5g瓊脂

49、和30g蔗糖，加熱，同時(shí)用玻璃棒不斷攪拌，直至溶液沸騰到顏色澄清；</p><p>　　⑹ 趁熱把溶液倒回大燒杯中，加入蒸餾水再次定容到1000ml（彌補(bǔ)沸騰蒸發(fā)所失去的水分），緊接著將培養(yǎng)基分裝到所選用的玻璃容器中，每個(gè)大概75ml；</p><p>　?、?擰好特質(zhì)的塑料蓋后，置于高壓滅菌鍋0.11MPa 121℃滅菌20分鐘；</p><p>　?、?滅好菌后

50、，將玻璃容器放置于接種用的無(wú)菌室中，使之冷卻，凝固，備用。</p><p>　　2.2.2 萱草外植體處理</p><p>　　萱草外植體選用幼嫩花梗，在接種前需將外植體進(jìn)行滅菌處理，處理步驟如下：</p><p>　?、?從健壯、無(wú)病蟲害的吉星萱草植株上選取幼嫩花梗，將之浸泡在裝有洗衣粉溶液的大燒杯中30min；</p><p>　?、?之

51、后置于自來(lái)水龍頭下，流水沖洗3至4小時(shí)，為防止花梗由于浮力而劃出燒杯，可以用紗布覆蓋燒杯口；</p><p>　　⑶ 在噴灑過70%乙醇和紫外燈消毒30min后的無(wú)菌室內(nèi)，開啟超凈工作臺(tái)，用浸泡在70%乙醇中的酒精棉擦洗臺(tái)面；</p><p>　?、?材料沖洗完后，戴上一次性手套，在超凈工作臺(tái)上分別對(duì)外植體進(jìn)行以下五組方法滅菌處理：</p><p>　　第一組：用7

52、0％酒精浸泡、振蕩15s傾出；</p><p>　　第二組：用0.2％HgCl2浸泡、振蕩8min；</p><p>　　第三組：用0.2％HgCl2浸泡、振蕩12min；</p><p>　　第四組：用70％酒精浸泡、振蕩15s傾出，然后再用0.2％HgCl2浸泡、振蕩8min；</p><p>　　第五組：用70％酒精浸泡、振蕩15s傾出

53、，然后再用0.2％HgCl2浸泡、振蕩12min，</p><p>　　這樣做是用于統(tǒng)計(jì)不同滅菌劑以及滅菌時(shí)間對(duì)外植體的影響；</p><p>　?、?在花梗進(jìn)行滅菌時(shí)，準(zhǔn)備好接種所需要的工具，包括培養(yǎng)皿、鑷子、酒精燈、濾紙、架子、刀片等，這些工具都事先經(jīng)過高壓滅菌鍋滅菌消毒，但是在擺放在超凈工作臺(tái)之前，還要先經(jīng)過酒精噴灑并置于酒精燈上灼燒3次，進(jìn)一步滅菌；</p><

54、p>　?、?萱草材料二次滅菌完畢后，用滅菌過的無(wú)菌水沖洗花梗6次；</p><p>　　⑺ 用消過毒并已經(jīng)冷卻的鑷子取出萱草花梗，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，使之水分被吸收；</p><p>　?、?用消毒后并冷卻了的刀片，在酒精燈旁切掉花梗被滅菌劑毒害的部分（呈黑色），將花梗切成2cm長(zhǎng)左右的莖段（圖2-2）。</p><p>　　圖2-2 萱草花梗莖段<

55、/p><p>　　2.2.3 接種及培養(yǎng)</p><p>　　萱草外植體經(jīng)過處理后，就要進(jìn)行接種，接種步驟如下：</p><p>　?、?取裝有培養(yǎng)基的玻璃容器，在酒精燈上方小心打開蓋子（打開時(shí)瓶口不可正對(duì)超凈工作臺(tái)風(fēng)口），并將瓶口和蓋子在火焰上方晃動(dòng)消毒；</p><p>　?、?放下瓶蓋，用鑷子將莖段小心放置于培養(yǎng)基表面，操作過程始終在酒精燈

56、旁，但不在培養(yǎng)皿上方；</p><p>　?、?接種好后，再次用火焰消毒瓶口和蓋子內(nèi)側(cè)，并在火焰旁蓋好蓋子；</p><p>　　⑷ 接種好后，盡量是接近平移的狀態(tài)將玻璃容器移置到培養(yǎng)室，進(jìn)行培養(yǎng)；</p><p>　?、?在初代培養(yǎng)成功，即產(chǎn)生叢生芽。</p><p>　　2.2.4 培養(yǎng)條件</p><p>　　在

57、植物組織培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件是：光照強(qiáng)度約為2000Lx，光照時(shí)間14h/d。采用恒溫培養(yǎng)，溫度為25±3℃ (圖2-3)。</p><p>　　圖2-3 萱草植物組織培養(yǎng)室</p><p>　　2.2.5 初代培養(yǎng)</p><p>　　將無(wú)污染宣草花梗莖段接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方分別是：</p><p&

58、gt;　?、?MS + BA(0.5mg/L) + NAA(0.05mg/L)；</p><p>　?、?MS + BA(0.5mg/L) + NAA(0.1mg/L)；</p><p>　?、?MS + BA(1.0mg/L) + NAA(0.05mg/L)；</p><p>　?、?MS + BA(1.0mg/L) + NAA(0.1mg/L),</p&g

59、t;<p>　　在上述培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀況，從中選擇出最優(yōu)組合。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率與成活率的影響</p><p>　　滅菌時(shí)間是從倒入滅菌液開始，至倒入無(wú)菌水時(shí)為止。滅菌主要是殺滅外植體表面的微生物及其產(chǎn)生的孢子，但不能殺

60、死寄生在植物內(nèi)部的病毒等。</p><p>　　表3-1不同滅菌劑及滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率及成活率的影響</p><p>　　從表3-1中進(jìn)行概率計(jì)算可知，單用70%乙醇做為滅菌劑處理外植體15s時(shí)，污染率高達(dá)88.0%；單用HgCl2做為滅菌劑處理外植體時(shí)，污染率分別為42.0%(8min)、48%(12min)；先用70%乙醇處理外植體15s，再用HgCl2處理外植體，污染率分別是1

61、6.0%(8min)、14.0%（12min）。但是，就成活率而言，70%乙醇溶液處理15s后，再用HgCl2處理8min的外植體成活率達(dá)90.5%；單用HgCl2處理外植體的，成活率緊隨其后，分別為86.2%(8min)、84.6%(12min)；而只用70%乙醇處理的外植體成活率最低，只有66.7%。因此，從污染率要低和成活率要高兩方面來(lái)考慮，用70%乙醇處理外植體15s后再用HgCl2處理8min是進(jìn)行萱草莖段滅菌的最佳滅菌劑組合

62、和滅菌時(shí)間。</p><p>　　3.2 不同激素組合對(duì)初代培養(yǎng)的影響</p><p>　　初代培養(yǎng)是指將萱草莖段接種到初代培養(yǎng)基上，使其生長(zhǎng)出愈傷組織的過程。萱草莖段的初代培養(yǎng)用MS基本培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基中只添加BA和NAA兩種激素。在該培養(yǎng)基上進(jìn)行一定時(shí)期的培養(yǎng)后，愈傷組織生長(zhǎng)情況如表3-2所示。</p><p>　　表3-2不同激素組合對(duì)萱草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

63、</p><p>　　圖3-1 顏色綠的愈傷組織</p><p>　　圖3-2 顏色淺綠的愈傷組織</p><p>　　圖3-3 顏色發(fā)白的愈傷組織</p><p>　　由上表可知，較低濃度的BA(0.5mg/L)和NAA(0.05mg/L)的組合誘導(dǎo)愈傷組織顏色發(fā)白、質(zhì)地松散；BA(0.5mg/L)和NAA(0.lmg/L)的組合誘導(dǎo)的愈傷

64、組織顏色綠、質(zhì)地松散；BA(1.0mg/L)和NAA(0.05mg/L)的組合誘導(dǎo)的愈傷組織顏色淺綠、質(zhì)地硬；BA(1.0mg/L)和NAA(0.1mg/L)的組合誘導(dǎo)的愈傷組織顏色綠、質(zhì)地硬?？紤]到愈傷組織應(yīng)顏色綠、質(zhì)地松散才比較容易長(zhǎng)出叢生芽，而且叢生芽質(zhì)量較好。因此，MS + BA(0.5mg/L) + NAA(0.1mg/L)的配方為最優(yōu)。</p><p>　　3.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)叢生芽增殖培養(yǎng)的

65、影響</p><p>　　將初代培養(yǎng)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)瓶，對(duì)其叢生芽的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察記錄（圖3-4，表5）。增殖系數(shù)越大，單位母株的繁殖效率越高。由結(jié)果可知，T2、T3、T5、T6和T9處理增殖系數(shù)較大，但T3處理的叢生芽細(xì)弱，因此考慮到叢生芽的增殖率和生長(zhǎng)狀況，T2、T5、T6和T9處理為較好的培養(yǎng)基組合。但考慮成本問題，以及過高的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑特別是2,4-D濃度會(huì)引起植物變異，經(jīng)綜合評(píng)價(jià)T2（MS + N

66、AA0.1 + 2,4-D1 + 6-BA2）處理為最佳。</p><p>　　圖3-4叢生芽生長(zhǎng)情況</p><p><b>　　表5叢生芽生長(zhǎng)情況</b></p><p>　　表6 組培苗生根數(shù)量的直觀分析表</p><p>　　表6為叢生芽增殖系數(shù)的直觀分析表。由表中可知，對(duì)叢生芽增殖系數(shù)影響最大的是2,4-D，N

67、AA和6-BA對(duì)該指標(biāo)不敏感。從各均值能夠看出，NAA的使用濃度以0.5 mg/L最好，2,4-D以2 mg/L為佳，6-BA則以2 mg/L最好，即叢生芽增殖率最大培養(yǎng)基為MS+ NAA0.5 + 2,4-D2 + 6-BA2，這個(gè)組合是通過計(jì)算得到的最優(yōu)處理，雖然試驗(yàn)里沒有做過，但可作為優(yōu)選的參考。</p><p><b>　　4 討 論</b></p><p>

68、　　4.1 萱草植物組織培養(yǎng)中的滅菌操作</p><p>　　大多是只用0.1%HgCl2單一滅菌劑進(jìn)行外植體的滅菌5-15min，或者是結(jié)合75%或70%酒精振蕩30s。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)合使用70％酒精和0.2％HgCl2交替浸泡萱草花梗，不僅節(jié)約時(shí)間、實(shí)驗(yàn)材料，還能保證除滅萱草外植體表面的常規(guī)微生物的有效性。酒精具有較強(qiáng)的穿透力和殺菌力，可使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性，但處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)引起植物細(xì)胞收縮脫水。酒精還具有

69、浸潤(rùn)作用，但只適用于表面滅菌，不能達(dá)到徹底滅菌的效果。HgCl2是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性，酶失活。但是，其對(duì)外植體的殺傷作用也較大，且較難清除，需用無(wú)菌水多次清洗，防止HgCl2的殘留對(duì)外植體帶來(lái)傷害。由于HgCl2有劇毒，所以一般情況下，應(yīng)盡量用其他滅菌劑，而少用或不用為宜。但是由于其滅菌效果最好，像萱草這類較難滅菌的植物上只能采用HgCl2。但使用后必須對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的處理，嚴(yán)禁隨意

70、傾倒，防止對(duì)環(huán)境造成污染。</p><p>　　4.2 萱草植物組織培養(yǎng)中對(duì)植物激素的選擇</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中植物激素是選擇了不同濃度的BA為細(xì)胞分裂素和NAA為生長(zhǎng)素。在組織培養(yǎng)中，加入細(xì)胞分裂素的目的，主要是為促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織或器官上分化叢生芽，而生長(zhǎng)素被用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。雖然天然生長(zhǎng)素2，4-D可能對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)更有效，但是基于組織培養(yǎng)技術(shù)必須

71、在無(wú)菌條件下操作，所有的材料包括藥品、培養(yǎng)基都要是絕對(duì)無(wú)菌，所以所選擇的植物激素要即使在高溫高壓的滅菌條件下也是穩(wěn)定的。天然的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素都無(wú)法承受該條件，故本實(shí)驗(yàn)采用了人工合成的BA和NAA，以保證操作條件的穩(wěn)定和外植體的正常生長(zhǎng)。</p><p>　　4.3 萱草植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的選擇</p><p>　　在本實(shí)驗(yàn)中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加以不同濃度的BA和NA

72、A進(jìn)行培養(yǎng)，最終確定初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基所添加到BA濃度分別是0.5mg/L和5.0mg/L，NAA濃度分別是0.1mg/L和0.5mg/L。培養(yǎng)溫度(25±2)℃,每天光照12 h,光照度1200-2200 lx條件。我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件為：在光照強(qiáng)度約為2000Lx，光照時(shí)間14h/d，采用恒溫培養(yǎng)，溫度為25±3℃。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</

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