劍尾魚(yú)腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系的建立及苯并(a)芘對(duì)其脅迫效應(yīng)的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(即PAHs)是指含有兩個(gè)苯環(huán)以上的一系列芳烴及其衍生物，來(lái)源于有機(jī)物熱解或不完全燃燒，生態(tài)系統(tǒng)中具有較強(qiáng)的持久性、生物活性、生物累積性和緩慢生物降解性，研究表明，由于其是誘導(dǎo)機(jī)體突變的物質(zhì)和致癌物質(zhì)的前體[2]，在環(huán)境中具有潛在的致癌、致畸和致突變性，可通過(guò)食物鏈危害人類健康。給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來(lái)一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。CYP1A1、CYP3A、GST和P-gp是生物體細(xì)胞內(nèi)參與PAHs環(huán)境污染物代謝的基因，當(dāng)生物體受到環(huán)境中PA

2、Hs暴露脅迫時(shí)，會(huì)直接影響CYP1A1、CYP3A、GST和P-gpmRNA的表達(dá)，CYP1A1、CYP3A、GST和P-gp在基因水平上的變化可作為良好生物標(biāo)志物對(duì)生物體所處的污染狀態(tài)和潛在危險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)警，并達(dá)到監(jiān)測(cè)PAHs環(huán)境污染物的目的。本研究選取PAHs中典型代表污染物苯并(a)芘，以劍尾魚(yú)為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以劍尾魚(yú)原代肝組織、劍尾魚(yú)腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行體外暴露實(shí)驗(yàn)，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)B(a)P分子水平生

3、物標(biāo)志物的研究，探討其對(duì)水環(huán)境存在的潛在危害，為其使用的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 主要研究包括：
　　 (1)利用SYBRGreenⅡ熒光定量PCR技術(shù)，建立了劍尾魚(yú)CYP1A1基因mRNA水平的定量分析方法。建立了劍尾魚(yú)CYP1A1基因表達(dá)的檢測(cè)方法和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建的劍尾魚(yú)CYP1A1和β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)品Ct值檢測(cè)范圍分別為10-26，12-26，擴(kuò)增效率分別為100.53％，98.40％；建立的標(biāo)

4、準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上；融解曲線分析結(jié)果顯示具有特異的單個(gè)峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性非常好。本實(shí)驗(yàn)建立了CYP1A1基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，能滿足檢測(cè)微量樣品中劍尾CYP1A1基因表達(dá)的要求。
　　 (2)以劍尾魚(yú)為試驗(yàn)動(dòng)物，研究苯并(a)芘在不同劑量及作用時(shí)間下對(duì)CYP1A1和P-gp基因表達(dá)的影響。體內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)，研究CYP1A1基因在劍尾魚(yú)各組織的表達(dá)情況，同時(shí)研究B(a)P對(duì)CYP1A1和

5、P-gp基因表達(dá)的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系：體外暴露實(shí)驗(yàn)，B(a)P暴露劍尾魚(yú)原代肝細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法對(duì)劍尾魚(yú)CYP1A1基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CYP1A1和P-gp基因在腦、脾、肝臟、腎、腸中均有表達(dá)，B(a)P對(duì)CYP1A1基因有誘導(dǎo)作用，對(duì)P-gp表達(dá)有抑制效應(yīng)；在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度下，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，CYP1A1基因的表達(dá)與B(a)P的暴露濃度均呈現(xiàn)很好的劑量一效應(yīng)關(guān)系，在暴露7dCYP1A1基因表達(dá)量達(dá)到

6、最高，P-gp的表達(dá)量隨誘導(dǎo)濃度的升高而降低，暴露3dP-gp的基因表達(dá)量最高；體外暴露肝組織塊實(shí)驗(yàn)，CYP1A1基因的表達(dá)與B(a)P的暴露濃度均呈現(xiàn)很好的劑量一效應(yīng)關(guān)系，在暴露48hCYP1A1基因表達(dá)量達(dá)到最高，P-gp的表達(dá)量總體上隨誘導(dǎo)濃度和時(shí)間的規(guī)律性不強(qiáng)，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)很有必要。
　　 (3)建立了劍尾魚(yú)腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系，本文采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行劍尾魚(yú)腦組織和胚胎組織的體外培養(yǎng)，并通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液

7、配方條件的優(yōu)化成功地進(jìn)行了劍尾魚(yú)腦細(xì)胞和胚胎的原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，兩種的最適培養(yǎng)液為含有15％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12+L-15培養(yǎng)液，添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及胰島素樣生長(zhǎng)因子，最適培養(yǎng)條件為27℃，5％CO2。細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)和分裂狀態(tài)良好，腦細(xì)胞為典型的神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)，胚胎細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞形態(tài)；經(jīng)連續(xù)繼代培養(yǎng)后，已成功建立了劍尾魚(yú)腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系，現(xiàn)已繼代培養(yǎng)腦細(xì)胞至

8、第95代，胚胎細(xì)胞至85代；兩株細(xì)胞系細(xì)胞經(jīng)液氮凍存復(fù)蘇后仍保持其原有細(xì)胞形態(tài)，其貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖速度也與凍存前無(wú)差異；生長(zhǎng)特性鑒定結(jié)果顯示，第65代劍尾魚(yú)腦細(xì)胞系細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為43.048h，60代胚胎細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為38.49h，表明細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂依然十分旺盛。染色體分析結(jié)果顯示，劍尾魚(yú)腦細(xì)胞和胚胎細(xì)胞特征性染色體數(shù)目為48條，表明所建立的細(xì)胞系確為劍尾魚(yú)腦細(xì)胞系和胚胎細(xì)胞系。
　　 (4)以劍尾魚(yú)腦細(xì)胞和胚胎細(xì)

9、胞為試驗(yàn)材料，通過(guò)SYBRGreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)苯并(a)芘在不同劑量及作用時(shí)間下劍尾魚(yú)腦細(xì)胞和胚胎細(xì)胞GST、CYP1A1、CYP3A和P-gpmRNA的相對(duì)表達(dá)量，來(lái)研究苯并(a)芘對(duì)劍尾魚(yú)腦細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示：在腦細(xì)胞中，B(a)P對(duì)CYP1A1mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著性誘導(dǎo)，存在很好的劑量一效應(yīng)關(guān)系，而在時(shí)間上呈現(xiàn)抑制的效應(yīng)；在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度下，P-gpmRNA、GSTmRNA的相對(duì)表達(dá)量變化趨

10、勢(shì)與CYP3AmRNA一致，相對(duì)表達(dá)量隨著B(niǎo)(a)P濃度的增加而不斷下降，呈現(xiàn)出抑制的效應(yīng)關(guān)系，而在時(shí)間上的效應(yīng)關(guān)系無(wú)明顯的規(guī)律。胚胎細(xì)胞中，苯并(a)芘對(duì)胚胎細(xì)胞CYP1A1也是呈現(xiàn)強(qiáng)誘導(dǎo)效應(yīng)，存在劑量一效應(yīng)關(guān)系；在時(shí)間上，低濃度呈現(xiàn)抑制效應(yīng)，高濃度組，呈現(xiàn)波動(dòng)式的先抑制后誘導(dǎo)再?gòu)?qiáng)抑制的效應(yīng)關(guān)系。B(a)P在時(shí)間和濃度上對(duì)P-gpmRNA、CYP3AmRNA的表達(dá)量均呈現(xiàn)抑制的效應(yīng)，對(duì)GSTmRNA的表達(dá)量影響規(guī)律不明顯。劍尾魚(yú)腦細(xì)胞