狂犬病病毒L蛋白聚合酶活性部位的原核表達(dá)與純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、狂犬病是一種人畜共患傳染病，死亡率極高，一旦發(fā)病100%死亡，對(duì)人民的生命安全造成了嚴(yán)重的威脅?？袢〔《臼且环N單鏈的不分節(jié)段的負(fù)股RNA病毒，共編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，其中L蛋白為狂犬病病毒中最大的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及翻譯后的加工。L蛋白是高度保守的蛋白，突變會(huì)嚴(yán)重影響它的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程。因此，對(duì)L蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究探索顯得尤為重要。
　　 本文通過RT-PCR方法擴(kuò)增了L蛋白的聚合酶活性部位基因片段，并將

2、其克隆至pMD18-T載體中，再亞克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-32a(+)上，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-L。轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)中用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用融合的His標(biāo)簽，通過Western blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，證實(shí)為L重組融合蛋白。通過SDS-PAGE分析，表明L蛋白以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，通過5 Mol尿素洗滌得到純度較高的重組蛋白，用逐步透析法進(jìn)行蛋白質(zhì)重折疊。將純化復(fù)性后的重組蛋白與弗氏完全佐劑乳化