擬蜘蛛牽絲蛋白基因的原核表達及多克隆抗體制備.pdf

1、蜘蛛牽絲因其優(yōu)異的機械性能越來越多地作為材料應用于醫(yī)療、建筑等領域。但天然蛛絲產量低，利用原核生物反應器生產重組蛛絲是目前人工獲得大量蛛絲的有效手段。本研究用擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)和二聚體(2S)分別構建了原核表達載體pGEX-S和pGEX-2S，轉化大腸桿菌并誘導其表達，用產量多的重組蛋白為抗原，免疫小白鼠以制備抗血清。通過此方法可以探索建立適宜的重組蛛絲原核表達體系，也為檢測其在真核表達提供材料。
　　本研究主要內容包括

2、：⑴擬蜘蛛牽絲蛋白基因序列的合成:根據(jù)棒絡新婦蛛的cDNA片段人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)，并構建了二聚體(2S)。⑵原核表達載體的構建:基因單體（S)合成后與克隆載體pUC57相連，得到重組質粒pUC57-S再通過酶切、連接、轉化等合成二聚體（2S）;分別將S和2S片段與表達載體pGEX-2T相連，獲得可用于原核表達的重組質粒pGEX-S和pGEX-2S。⑶重組蛋白的表達和純化:將重組質粒pGEX-S和pGEX-2S轉化入表達

3、型感受態(tài)細胞BL21中，并對菌株的表達條件進行了摸索，發(fā)現(xiàn)0.8mmol/l的IPTG誘導4小時為最好。提取總蛋白進行Western Blot，發(fā)現(xiàn)S-GST的表達量明顯高于2S-GST。利用親和層析法純化重組蛋白S-GST，用于多克隆抗體的制備。⑷擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)多克隆抗體的制備:取適量純化后S-GST重組蛋白與佐劑混合乳化，利用皮下多點注射的方法免疫8只CDⅠ小白鼠，免疫結束后經ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)其中的兩只小鼠的抗血清