狂犬病病毒受體NCAM、P75和nAchR的原核表達(dá)、多克隆抗體的制備以及病毒感染對細(xì)胞受體的影響.pdf

1、狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)是彈狀病毒科狂犬病毒屬的成員,具有高度的嗜神經(jīng)性并且能引起致命的腦炎。目前沒有有效的治療方法,病死率幾乎100％?？袢〔《揪幋a五種蛋白,其中 G蛋白在決定病毒的宿主范圍、嗜神經(jīng)毒力、病毒的免疫原性及與宿主細(xì)胞表面受體分子的相互作用等方面起著重要的作用。病毒的細(xì)胞受體是病毒侵入靶細(xì)胞的門戶,能與病毒特異性的結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵易感宿主細(xì)胞而啟動其復(fù)制過程。RV在侵入神經(jīng)肌肉接頭時,位于突觸后膜的

2、nAchR和位于突觸前膜的NCAM起到重要的介導(dǎo)作用。神經(jīng)營養(yǎng)素受體P75同樣作為狂犬病病毒的一個受體,當(dāng)病毒進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞后,P75可與狂犬病病毒 G蛋白結(jié)合從而使病毒進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)行逆向傳遞。
　　本課題從感染Flury毒株1 h的NA細(xì)胞中抽提總RNA,從總RNA中合成并克隆了NCAM、P75和nAchR基因,將這些基因片段插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)克隆位點(diǎn),并成功構(gòu)建了pET-NCAM-711、pET-P75-5

3、13和pET-nAchR-525的重組原核表達(dá)質(zhì)粒。將這些原核重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中,分別經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)而表達(dá)NCAM-711、P75-513和nAchR-525三種重組蛋白。SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)的三種重組蛋白 NCAM-711、P75-513和nAchR-525分別表達(dá)出52、45和47 KD的融合蛋白,同時證實(shí),NCAM-711和nAchR-525主要以包涵體的形式表達(dá),而P75-51

4、3則主要以可溶性蛋白的形式表達(dá)。分別經(jīng)過Ni-NTA樹脂純化重組蛋白,以純化的重組蛋白為抗原與弗氏佐劑乳化免疫小鼠,制備NCAM、P75和nAchR多克隆抗體。
　　由于自然狀態(tài)下這三個受體在細(xì)胞表面的表達(dá)量很低,常規(guī)方法 IFA和WB等的反應(yīng)很弱,難以達(dá)到檢測標(biāo)準(zhǔn),因此分別構(gòu)建了三個受體的真核表達(dá)質(zhì)粒 NCAM-1818-3.0、P75-1284-myc和nAchR-1509-myc。轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,獲得過表達(dá)NCAM、P

5、75和nAchR三個蛋白的BHK-21細(xì)胞。
　　分別以正常的NA細(xì)胞以及真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞24 h后收集的細(xì)胞和細(xì)胞蛋白為樣品,用IFA和Western-blot方法檢測細(xì)胞表面的受體蛋白與抗體的反應(yīng)性。IFA結(jié)果表明,制備的NCAM、P75和nAchR多克隆抗體分別與NA細(xì)胞上的三種受體結(jié)合都顯示特異性熒光。Western-blot結(jié)果表明,制備的抗NCAM和P75蛋白的兩種多克隆抗體可與相應(yīng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染受體蛋白N

6、CAM和P75反應(yīng),而nAchR多克隆抗體可與NA細(xì)胞及轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞上的nAchR結(jié)合,IFA可看到熒光,但用Western-blot的方法檢測不到細(xì)胞表面的nAchR蛋白。
　　應(yīng)用制備的三種受體蛋白多抗用流式細(xì)胞術(shù)測定三種細(xì)胞 NA、BHK-21和RAW264.7感染RC-HL株后,NCAM、P75和nAchR三種受體蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示,三種受體蛋白在NA細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞中上調(diào)約2倍左右,但在RAW26

7、4.7細(xì)胞中的表達(dá)較接毒前上調(diào)更加顯著,分別上調(diào)8、9和6.3倍。
　　在此基礎(chǔ)上用實(shí)時熒光定量PCR在mRNA水平上測定NA、BHK-21和RAW264.7細(xì)胞感染RV弱毒毒株RC-HL后NCAM、P75和nAchR這三個受體的表達(dá)情況。結(jié)果表明,RC-HL感染24 h后NCAM、P75和nAchR三種基因的mRNA都有不同程度的上調(diào)。NCAM、P75和nAchR的mRNA的表達(dá)相對于接毒前,NA細(xì)胞中分別上調(diào)79.3、28.2

8、和8.7倍,BHK-21細(xì)胞中分別上調(diào)3.5、1.9和1.8倍和RAW264.7細(xì)胞中分別上調(diào)10.97、9.1和3.5倍。
　　通過擴(kuò)增三種受體基因并克隆構(gòu)建原核表達(dá)載體后進(jìn)行蛋白純化,成功制備了三個受體的多克隆抗體;三種受體抗體與三種受體蛋白均有特異反應(yīng)性;用制備得到的三種受體多抗檢測三種細(xì)胞感染RV后,證實(shí)三種受體蛋白表達(dá)上調(diào);RV感染后同樣可以誘導(dǎo)這三種受體基因 mRNA表達(dá)上調(diào),與蛋白水平結(jié)果一致。表明在狂犬病病毒感染的