豬胚胎ZFN敲除技術(shù)體系的探索.pdf

1、ZFN技術(shù)作為一種基因組修飾工具，具有高效、特異及適用性廣泛的特點(diǎn)，近年來(lái)發(fā)展迅速，已成功應(yīng)用于多種有機(jī)體及細(xì)胞類(lèi)型的基因敲除。ZFN由一個(gè)非特異的FokⅠ核酸內(nèi)切酶DNA切割結(jié)構(gòu)域和一個(gè)特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。ZFN進(jìn)入細(xì)胞后可在基因組定點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂，通過(guò)細(xì)胞對(duì)基因組DNA的自我修復(fù)途徑可使基因打靶效率提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。本研究擬采用這一技術(shù)探索豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體的敲除。PRRSV有三個(gè)相應(yīng)受體，分別是唾液酸黏附素(Sia

2、loadhesin，Sn)、硫酸乙酰肝素、CD163分子，其中Sn起關(guān)鍵作用，既能介導(dǎo)病毒吸附又能介導(dǎo)內(nèi)吞，因此我們選擇Sn基因作為敲除的靶基因，以提高豬對(duì)PRRSV的抗性。本實(shí)驗(yàn)擬探索通過(guò)ZFN技術(shù)敲除豬胎兒成纖維細(xì)胞系的Sn基因，并通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)，構(gòu)建Sn基因敲除重構(gòu)胚的技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)豬基因的高效定點(diǎn)敲除奠定基礎(chǔ)。主要包括以下三個(gè)內(nèi)容:
　　 第一、豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)和電穿孔轉(zhuǎn)染研究首先成功分離并獲得了豬胎兒

3、成纖維細(xì)胞，并利用該細(xì)胞探索高效電轉(zhuǎn)染方案。以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，對(duì)質(zhì)粒濃度，電壓和脈沖時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，并比較了不同溫度處理對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響以及電壓對(duì)細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明，在設(shè)定的范圍內(nèi)，三個(gè)因素中質(zhì)粒濃度影響最大，質(zhì)粒濃度和電壓對(duì)轉(zhuǎn)染效率均有顯著影響，脈沖時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響差異不顯著。不同溫度處理對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響差異不顯著，電壓顯著影響細(xì)胞存活率。細(xì)胞在常溫條件下，采用40μg/ml質(zhì)粒濃

4、度，280V電壓和800μs脈沖時(shí)間可以獲得最高89.8％的轉(zhuǎn)染效率。
　　 第二、豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育及核移植系統(tǒng)的優(yōu)化從豬卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎體外激活著手，通過(guò)優(yōu)化成熟培養(yǎng)液中激素添加方式和胚胎激活方案，建立了較完善的豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌發(fā)育系統(tǒng)，在此系統(tǒng)下，屠宰場(chǎng)卵巢分離培養(yǎng)的卵母細(xì)胞體外成熟率達(dá)到80％，卵裂率達(dá)到90％，孤雌囊胚率達(dá)到50％。將此優(yōu)化后的成熟和激活系統(tǒng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植胚胎的體外發(fā)育，獲得了1