優(yōu)化巴馬香豬超排和利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立PDX-1基因敲除豬的研究.pdf

1、小型豬作為模式動物由來已久，相比小鼠等模式生物，小型豬模型體重與人類相當(dāng)，器官大小也與人類器官相似，而且在生理生化、解剖學(xué)和疾病發(fā)生機(jī)理等方面都與人類極為相似，許多基因在嚙齒類動物模型中不具備與人體類似的生理代謝相關(guān)功能，而豬相比嚙齒類模型更貼近于人，通過在豬上研究相關(guān)基因的功能可以更好的驗證其功能。這些優(yōu)勢都使小型豬模型動物比之其他動物模型不論生物或是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中都具有極為重要的科研和應(yīng)用價值。在CRISPR/Cas系統(tǒng)出現(xiàn)之前，沒

2、有合適的胚胎干細(xì)胞系一直是限制小型豬基因敲除的主要因素，CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)從技術(shù)上打破了這一僵局極大的方便了豬基因敲除模型的建立。
　　PDX-1基因在胰腺發(fā)育中起著重要作用，早期胚胎發(fā)育時期，胰腺的發(fā)育主要是通過背腹兩側(cè)的上皮芽進(jìn)行融合從而形成胰芽。在小鼠中生產(chǎn)PDX-1基因敲除純合子小鼠后發(fā)現(xiàn)，純合敲除的小鼠缺乏成熟的胰腺組織，并且十二指腸的部分區(qū)域也呈現(xiàn)異常狀態(tài)。出生后的小鼠不能存活很久，會很快死于高血糖。巴馬

3、香豬上PDX-1基因在豬并沒有做過敲除研究，尚不清楚其在豬上的功能。
　　本論文主要研究在小型豬上如何通過超數(shù)排卵獲得大量優(yōu)質(zhì)胚胎用于胞漿注射，從而使用CRISPR/Cas9技術(shù)得到PDX-1基因敲除的動物模型。在小型豬上獲得胚胎的傳統(tǒng)途徑主要是通過體外IVF、NT、ICSI和孤雌等手段，但由于豬體外培養(yǎng)體系的不完善，導(dǎo)致這些手段共同的缺陷是獲得的胚胎發(fā)育能力較差，囊胚細(xì)胞數(shù)較小。而通過超數(shù)排卵獲得的體內(nèi)胚胎可以極大程度避免體外培

4、養(yǎng)對胚胎發(fā)育造成影響，從而提供大量優(yōu)質(zhì)胚胎用于胞漿注射，建立快速穩(wěn)定的生產(chǎn)基因敲除豬模型動物的實驗平臺。
　　綜合實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)巴馬香豬的最佳超排程序方案是:在發(fā)情第15天早上9:00按11 IU/kg頸后肌肉注射氯前列烯醇(PG-CL)，間隔8h后再次注射PG-CL，隔天9:00注射21 IU/kg的孕馬血清促性腺激素(PMSG)。間隔72h后按16.7 IU/kg注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)，注射hCG24h后進(jìn)行查