玉米耐旱功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)及優(yōu)異單倍型應(yīng)用.pdf

1、玉米(Zea Mays L.)是全球重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物之一,在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人類糧食安全中占有舉足輕重的地位。然而,干旱嚴(yán)重影響了玉米生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。玉米種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏有豐富的基因等位變異,通過(guò)關(guān)聯(lián)分析方法不僅可以檢測(cè)到功能單核苷酸多態(tài)性(SNP)變異位點(diǎn),而且可以發(fā)掘與耐旱密切相關(guān)的優(yōu)異等位基因變異,然后根據(jù)基因的變異信息和遺傳變異規(guī)律開(kāi)發(fā)功能性分子標(biāo)記,從而用于玉米耐旱分子標(biāo)記輔助選擇育種中。
　　本研究以我國(guó)玉

2、米生產(chǎn)上常用的210份自交系為試驗(yàn)材料,根據(jù)全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果,針對(duì)與耐旱有關(guān)的功能位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記開(kāi)發(fā),在不同種質(zhì)背景中進(jìn)行耐旱性驗(yàn)證。同時(shí),對(duì)已經(jīng)鑒定出含耐旱優(yōu)異單倍型的玉米Zmivr2基因,構(gòu)建新型高效表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化并創(chuàng)制耐旱新品種。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),有29個(gè)SNP位點(diǎn)至少與1個(gè)或多個(gè)環(huán)境下的2種表型性狀相關(guān)聯(lián)并且與耐旱或耐旱響應(yīng)基因有關(guān)。其中,編號(hào)為PZA0355.1和PZA0

3、1671.1的SNP更是與多個(gè)耐旱性狀表型密切相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)分析表明PZA0355.1含有G/ASNP變異位點(diǎn),其注釋基因?yàn)閐hn1,位于6號(hào)染色體;PZA01671.1同樣為A/GSNP變異位點(diǎn),其注釋基因?yàn)閞sp41,位于5號(hào)染色體?；谶@兩個(gè)功能SNP變異位點(diǎn)可分別開(kāi)發(fā)CAPS標(biāo)記dhnC397和rspC1090,用于分析和驗(yàn)證不同種質(zhì)材料的耐旱性。
　　(2)在dhnC397標(biāo)記中,對(duì)210份玉米自交系進(jìn)行基因型驗(yàn)證

4、,發(fā)現(xiàn)有205份自交系能擴(kuò)增出大小為164bp目的片段。經(jīng)過(guò)StyI酶切后,53份自交系被酶切成大小為131bp和33bp的兩條片段,與此同時(shí)138份自交系由于缺少酶切識(shí)別位點(diǎn)而未被切開(kāi)。然后對(duì)這205份自交系進(jìn)行耐旱性綜合評(píng)價(jià),將試驗(yàn)材料分為高度耐旱,耐旱,中等,干旱敏感和高度干旱敏感5種類型。研究發(fā)現(xiàn),在G等位變異自交系中含有7份耐旱自交系和24份旱敏感自交系所占比例分別為12.7％和43.6%;在A等位變異自交系中含33份耐旱自交

5、系和53份旱敏感自交系所占比例分別為23.7%和38.1%。由此看出含A等位變異自交系的耐旱性優(yōu)于G等位變異自交系的耐旱性。通過(guò)分析耐旱選擇指標(biāo)發(fā)現(xiàn)無(wú)論屬于哪種等位變異,雜種優(yōu)勢(shì)群B的自交系耐旱性要強(qiáng)于雜種優(yōu)勢(shì)群A的自交系。
　　(3)在rspC1090標(biāo)記中,有204份自交系能擴(kuò)增出286bp大小的目的片段。經(jīng)過(guò)HpaII酶切后,108份自交系被酶切成含有225bp和61bp的兩條片段,而有87份自交系沒(méi)有被切開(kāi)。對(duì)這204份自

6、交系進(jìn)行耐旱性評(píng)價(jià)分析發(fā)現(xiàn)在G等位變異自交系中含有30份耐旱自交系和31份旱敏感自交系分別占比例的27.8%和28.7%;在A等位變異自交系中含10份耐旱自交系和47份旱敏感自交系分別占總比例的11.6%和54.7%。因此,含G等位變異自交系的耐旱性強(qiáng)于含A等位變異的自交系。此外,通過(guò)進(jìn)行耐旱選擇指標(biāo)分析,同樣發(fā)現(xiàn)屬于雜種優(yōu)勢(shì)群B的自交系耐旱性都要強(qiáng)于雜種優(yōu)勢(shì)群A的自交系。
　　(4)通過(guò)對(duì)候選基因Zmivr2關(guān)聯(lián)分析,鑒定出優(yōu)異

7、單倍型。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Zmivr2基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)SOPMA軟件分析Zmivr2基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該基因主要是由α螺旋(11.74%),延伸鏈(24.07%)和隨機(jī)卷曲(64.19%)組成。采用SWISS-MODEL軟件對(duì)含優(yōu)異單倍型和普通Zmivr2基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),再用SPDBV4.01軟件對(duì)比其三級(jí)結(jié)構(gòu)可看出兩者空間結(jié)構(gòu)上存在一定的差異,其中在259處由精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?在414處由半胱氨酸突變?yōu)榫?/p>

8、氨酸,因此含優(yōu)異單倍型的Zmivr2基因可能在植物耐旱上起一定的作用。
　　(5)通過(guò)In-FusionPCR克隆技術(shù)成功構(gòu)建含有優(yōu)異單倍型的Zmivr2基因植物過(guò)表達(dá)載體pCUB-ubi-Zmivr2。然后以玉米自交系昌7-2為供體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)PCR檢測(cè)有1株為陽(yáng)性并結(jié)實(shí)。將獲得的30粒T1代昌7-2轉(zhuǎn)基因種子種植于溫室待其生長(zhǎng)到3-4葉期進(jìn)行PCR檢測(cè),其中有4株呈現(xiàn)陽(yáng)性。然后,將收獲的4株陽(yáng)性株T2代昌7